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Elabscience_流式实验如何配色?
470 人阅读发布时间:2022-08-30 09:23
第一步,根据实验目的,选择目标Marker。
通过阅读相关文献,了解您实验需要选择哪些Marker,以及这些Marker之间的逻辑关系(圈门的父子关系,比如T细胞CD3是“父”,而CD4或者CD8就是“子”)。
这里列举了一些常见的细胞标志Marker:
Human | Marker |
B Cells |
CD19 |
T Cells |
CD3, CD4, CD8 |
Treg Cells |
CD4, CD25, CD127 |
Th1/Th2/Th17 Cells |
CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17 |
Dendritic Cells |
CD1c, CD83, CD141, CD209, MHC II |
Natural Killer Cells |
CD3-, CD16, CD56 |
Macrophage |
CD11b, CD68, CD163 |
Monocyte |
CD14, CD16, CD64 |
Plasma Cells |
CD138 |
Red Blood Cells |
CD235a |
Mouse | Marker |
B Cells |
CD19 |
T Cells |
CD3, CD4, CD8 |
Treg Cells |
CD4, CD25, Foxp3 |
Th1/Th2/Th17 Cells |
CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17 |
Dendritic Cells |
CD11c, MHC II |
Natural Killer Cells |
CD3-, CD49b (clone DX5) or NK1.1 |
Macrophage |
F4/80, CD11b, CD80, CD86, CD206 |
Monocyte |
CD11b, CD115, Gr-1, Ly-6C |
Plasma Cells |
CD138 |
Red Blood Cells |
TER-119 |
第二步,确认Marker的表达位置。
对于细胞质或者细胞核的Marker,需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核Marker染色实验操作时,需要先染细胞表面Marker,再对细胞进行固定破膜,最后对胞内或核内Marker染色。此时细胞表面的Marker尽量避免使用串联染料,因为“固定”容易对串联荧光素造成影响。
一般来说,绝大部分CD分子指标,都是细胞表面指标;IL白介系列、IFN-γ、TNF-α等,属于胞内指标;而最常见的核内染色指标是Foxp3。
确认Marker表达位置的同时,我们还需要了解Marker的表达量。前面提到过“强弱搭配”,我们需要通过表达量的强弱,来搭配荧光素的弱强。
通常,根据待测细胞类型中,相应抗原的表达量,可以粗略地将抗原分子分为三类:
01
很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如: CD3,CD4,CD19等。
02
很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如: CD27,CD28,CD45RA, CD45RO等。
03
低水平表达、激活性Marker、未知但关键。例如: CD25,STAT5,Foxp3等。
CD4
CD45R
CD25
表达量的强弱,可以参考厂家的质检结果,但更多地需要参考文献里具体细胞群体的表达。
第三步,了解实验所用流式细胞仪的配置信息,包括:流式细胞仪的激光器、检测通道和滤光片等。
上期提到:流式细胞仪是同时检测多种荧光的,这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道,来确认有哪些荧光素可以选择,这样可以在后期搭配的时候,尽量避免干扰。如果没有仪器的通道信息,是无法去确定哪些荧光素可供选择的。可以说,如果没有仪器通道信息,配色就是“无源之水,无本之木”。
通过仪器通道信息,确认可以选择哪些荧光素后,我们还需要了解荧光素的信息,确认这些荧光素的激发波长和发射波长、接收该荧光的滤光片等信息,是否和流式细胞仪的通道一致。
▲ 常见荧光基团信息
第四步,了解荧光素的强度。
下表列出了常见荧光素的强度:
在已确定Marker的强弱,和流式细胞仪可检测的荧光素的强弱后,我们要遵循“强弱搭配原则”,进行配色。
强表达抗原,可以选择弱荧光素,也可以选择强荧光素。
如下图所示,强表达抗原CD3,选择弱荧光素FITC或强荧光素APC,对实验结果影响不大。
弱表达抗原,一定要选择强荧光素。
如下图所示,弱表达的抗原CD25,选择弱荧光素PerCP,会导致阴阳性细胞群分不开。如果选择强荧光素PE,可以看到明显的阳性细胞群。
当然,有些老师在配色时,也会遇到一些其他的问题,如:细胞样本有自发荧光、细胞处理容易出现死细胞(需要额外增加死活细胞染料)等。因此,我们需要特别注意,将对应通道的荧光检测信息,预留给自发荧光,或者死活染料检测。
相信在了解了流式配色的基本原则及操作步骤后,大家的实验也能更加顺利地开展啦~
配色是一个需要多因素考虑的工作,如果您在阅读完本文后,具体操作时还是不清楚如何配色,欢迎填写下面的配色服务需求表,我们的技术支持会给您提供专业的免费配色服务。