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生化检测常见样本的收集及处理方法
人阅读 发布时间：2019-06-14 11:49
一、液体样本的处理
1. 血清样本
取新鲜血液，在 25 ℃ 条件下静置 30 min 使血液凝结。4 ℃，2000×g 离心 15 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
2. 血浆及红细胞样本
取新鲜血液加入含有抗凝剂的试管中，颠倒混匀，4 ℃，700～1000×g 离心 10 min，取上层淡黄色透明液体即为血浆，不能吸取中间白色干扰层（白细胞和血小板）。将血浆置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
将中间白色干扰层舍去，将下层红细胞沉淀，用 4 倍体积 2～8 ℃ 的超纯水裂解，于 4 ℃，10000×g 离心 15 min，上清液即为红细胞溶解物。
3. 全血样本
取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中，轻轻颠倒混匀，置于冰上待测。若不能当天检测测，4 ℃ 保存 2 天。
4. 尿液样本
收集新鲜尿液，4 ℃，10000×g 离心 15 min，取上清于冰上待测。若不能当天测，放入 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
5. 胸水样本
收集新鲜胸水，加入含有抗凝剂的试管中，4 ℃，1500×g 离心 10 min，取上清于冰上待测，若不能当天测，保存在 -80 ℃ 中，可储存一个月。
6. 脑脊液样本
将收集的脑脊液，4 ℃，1500×g 离心 10 min，取上清于冰上待测，若不能当天测，保存在 -80 ℃ 中，可储存一个月。
7. 高脂血清样本
① 高速离心法：
于 4 ℃，10000×g 离心 15 min 后，用棉签吸弃上层乳白色液体，吸取中层澄清血清于冰上待测。
② ether 萃取法：
取血清与 ether 1:1 混合，涡旋混匀仪震荡 30 秒，室温静置 5 分钟，4 ℃，1500×g 离心 5 min，枪头穿过 ether 层，取下层清亮血清进行测量。[1]
③ 生理盐水稀释法：
将血清与生理盐水按照 1:4（具体稀释倍数按照指标确定）稀释后混匀待测（适用于轻度高脂样本）。
④ 沉淀分离法：
将血清用联合沉淀剂磷钨酸-镁沉淀剂或者聚乙二醇-硫酸葡聚糖沉淀剂沉淀[2]，4 ℃，1500×g 离心 10 min 后，取上清待测。（具体沉淀剂的种类及浓度需要按指标确定）。
二、细胞、组织及菌类等需匀浆处理的样本的处理
1. 细胞样本
悬浮细胞：
4 ℃，1000-2000×g 离心 10 min 收集细胞，按照 106 个细胞加入 300～500 μL 匀浆介质的比例加入匀浆介质，进行机械匀浆，充分破碎（无明显的细胞沉淀，可在显微镜下观察），4 ℃，10000×g 离心 10 min，取上清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可保存一个月。
贴壁细胞：
吸弃培养液，用 PBS（0.01 M，pH 7.4）将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞（不能用胰酶和 EDTA 处理），加入 2～5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4），收集细胞悬液，后处理方法见悬液细胞处理方法。
2. 10% 组织匀浆
取 0.020～1.0 g 新鲜组织块，用 2～8 ℃ 的 PBS（0.01 M，pH 7.4）漂洗，去除血液，滤纸吸干，称重，放入匀浆容器中，按照重量（g）:体积（mL）=1:9 的比例加入 2～8 ℃ 的匀浆介质，进行匀浆，4 ℃，10000×g 离心 10 min，取上清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可保存一个月。
3. 线粒体样本
将 10% 组织匀浆，4 ℃，1500×g 离心 10 min，将上清液 4 ℃，10000×g 离心 15 min，弃去上清，沉淀即为线粒体。加入匀浆介质溶解后待测。
4. 脂肪组织
取新鲜组织块（20 mg～1.0 g），按照重量（g）：体积（mL）=1:9 的比例加入 2～8 ℃ 的匀浆介质，进行匀浆，4 ℃，1500×g 离心 10 min，用棉签吸取上层乳白色液体，吸取中层澄清液体待测。
5. 微生物样本
将菌液于 4 ℃、1000～2000×g 离心 10 min 收集细菌，用 PBS（0.01 M，pH 7.4）将菌沉淀洗 2～3 遍，然后按照原菌液体积的 1/5～1/10 加入裂解液（一般为 50 mM Tris-HCl，pH 8.0，2 mM EDTA，100 mM NaCl，加溶菌酶至 100 ug/ml，0.1% Triton X-100，具体情况根据所测指标选择）重悬菌体，在冰水浴条件下，超声破碎（条件一般是 300w，超声 10s 间隔 10s，总时间 10 分钟，具体条件可根据自身情况而定）。
如何判断是否超声完全：
① 外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
② 液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
③ 高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用 6000×g 离心 10 min，比一般离心收集菌体的转速高一点）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
一些需要注意的问题：
① 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
② 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
③ 尽量防止泡沫的产生。
1. 血清样本
取新鲜血液，在 25 ℃ 条件下静置 30 min 使血液凝结。4 ℃，2000×g 离心 15 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
2. 血浆及红细胞样本
取新鲜血液加入含有抗凝剂的试管中，颠倒混匀，4 ℃，700～1000×g 离心 10 min，取上层淡黄色透明液体即为血浆，不能吸取中间白色干扰层（白细胞和血小板）。将血浆置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
将中间白色干扰层舍去，将下层红细胞沉淀，用 4 倍体积 2～8 ℃ 的超纯水裂解，于 4 ℃，10000×g 离心 15 min，上清液即为红细胞溶解物。
3. 全血样本
取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中，轻轻颠倒混匀，置于冰上待测。若不能当天检测测，4 ℃ 保存 2 天。
4. 尿液样本
收集新鲜尿液，4 ℃，10000×g 离心 15 min，取上清于冰上待测。若不能当天测，放入 -80 ℃ 保存，可储存一个月。
5. 胸水样本
收集新鲜胸水，加入含有抗凝剂的试管中，4 ℃，1500×g 离心 10 min，取上清于冰上待测，若不能当天测，保存在 -80 ℃ 中，可储存一个月。
6. 脑脊液样本
将收集的脑脊液，4 ℃，1500×g 离心 10 min，取上清于冰上待测，若不能当天测，保存在 -80 ℃ 中，可储存一个月。
7. 高脂血清样本
① 高速离心法：
于 4 ℃，10000×g 离心 15 min 后，用棉签吸弃上层乳白色液体，吸取中层澄清血清于冰上待测。
② ether 萃取法：
取血清与 ether 1:1 混合，涡旋混匀仪震荡 30 秒，室温静置 5 分钟，4 ℃，1500×g 离心 5 min，枪头穿过 ether 层，取下层清亮血清进行测量。[1]
③ 生理盐水稀释法：
将血清与生理盐水按照 1:4（具体稀释倍数按照指标确定）稀释后混匀待测（适用于轻度高脂样本）。
④ 沉淀分离法：
将血清用联合沉淀剂磷钨酸-镁沉淀剂或者聚乙二醇-硫酸葡聚糖沉淀剂沉淀[2]，4 ℃，1500×g 离心 10 min 后，取上清待测。（具体沉淀剂的种类及浓度需要按指标确定）。
二、细胞、组织及菌类等需匀浆处理的样本的处理
1. 细胞样本
悬浮细胞：
4 ℃，1000-2000×g 离心 10 min 收集细胞，按照 106 个细胞加入 300～500 μL 匀浆介质的比例加入匀浆介质，进行机械匀浆，充分破碎（无明显的细胞沉淀，可在显微镜下观察），4 ℃，10000×g 离心 10 min，取上清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可保存一个月。
贴壁细胞：
吸弃培养液，用 PBS（0.01 M，pH 7.4）将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞（不能用胰酶和 EDTA 处理），加入 2～5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4），收集细胞悬液，后处理方法见悬液细胞处理方法。
2. 10% 组织匀浆
取 0.020～1.0 g 新鲜组织块，用 2～8 ℃ 的 PBS（0.01 M，pH 7.4）漂洗，去除血液，滤纸吸干，称重，放入匀浆容器中，按照重量（g）:体积（mL）=1:9 的比例加入 2～8 ℃ 的匀浆介质，进行匀浆，4 ℃，10000×g 离心 10 min，取上清置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80 ℃ 保存，可保存一个月。
3. 线粒体样本
将 10% 组织匀浆，4 ℃，1500×g 离心 10 min，将上清液 4 ℃，10000×g 离心 15 min，弃去上清，沉淀即为线粒体。加入匀浆介质溶解后待测。
4. 脂肪组织
取新鲜组织块（20 mg～1.0 g），按照重量（g）：体积（mL）=1:9 的比例加入 2～8 ℃ 的匀浆介质，进行匀浆，4 ℃，1500×g 离心 10 min，用棉签吸取上层乳白色液体，吸取中层澄清液体待测。
5. 微生物样本
将菌液于 4 ℃、1000～2000×g 离心 10 min 收集细菌，用 PBS（0.01 M，pH 7.4）将菌沉淀洗 2～3 遍，然后按照原菌液体积的 1/5～1/10 加入裂解液（一般为 50 mM Tris-HCl，pH 8.0，2 mM EDTA，100 mM NaCl，加溶菌酶至 100 ug/ml，0.1% Triton X-100，具体情况根据所测指标选择）重悬菌体，在冰水浴条件下，超声破碎（条件一般是 300w，超声 10s 间隔 10s，总时间 10 分钟，具体条件可根据自身情况而定）。
如何判断是否超声完全：
① 外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
② 液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
③ 高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用 6000×g 离心 10 min，比一般离心收集菌体的转速高一点）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
一些需要注意的问题：
① 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
② 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
③ 尽量防止泡沫的产生。
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