流式实验如何配色

我们解读过“流式配色基本原则”

 

选择干扰少的荧光组合

使分析的复杂程度降到最低

谨慎使用串联染料

注意环境因素对荧光素的影响

我们该如何运用这些原则进行配色呢？

 

第一步，根据实验目的，选择目标Marker。

 

通过阅读相关文献，了解您实验需要选择哪些Marker，以及这些Marker之间的逻辑关系（圈门的父子关系，比如T细胞CD3是“父”，而CD4或者CD8就是“子”）。

 

这里列举了一些常见的细胞标志Marker：

Human	Marker
B Cells	CD19
T Cells	CD3, CD4, CD8
Treg Cells	CD4, CD25, CD127
Th1/Th2/Th17 Cells	CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17
Dendritic Cells	CD1c, CD83, CD141, CD209, MHC II
Natural Killer Cells	CD3-, CD16, CD56
Macrophage	CD11b, CD68, CD163
Monocyte	CD14, CD16, CD64
Plasma Cells	CD138
Red Blood Cells	CD235a

 

Mouse	Marker
B Cells	CD19
T Cells	CD3, CD4, CD8
Treg Cells	CD4, CD25, Foxp3
Th1/Th2/Th17 Cells	CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17
Dendritic Cells	CD11c, MHC II
Natural Killer Cells	CD3-, CD49b (clone DX5) or NK1.1
Macrophage	F4/80, CD11b, CD80, CD86, CD206
Monocyte	CD11b, CD115, Gr-1, Ly-6C
Plasma Cells	CD138
Red Blood Cells	TER-119

 

第二步，确认Marker的表达位置。

 

对于细胞质或者细胞核的Marker，需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核Marker染色实验操作时，需要先染细胞表面Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内Marker染色。此时细胞表面的Marker尽量避免使用串联染料，因为“固定”容易对串联荧光素造成影响。

一般来说，绝大部分CD分子指标，都是细胞表面指标；IL白介系列、IFN-γ、TNF-α等，属于胞内指标；而最常见的核内染色指标是Foxp3。

确认Marker表达位置的同时，我们还需要了解Marker的表达量。前面提到过“强弱搭配”，我们需要通过表达量的强弱，来搭配荧光素的弱强。

 

通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类：

 

 

01

很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如: CD3，CD4，CD19等。

 

02

很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如: CD27，CD28，CD45RA, CD45RO等。

 

03

低水平表达、激活性Marker、未知但关键。例如: CD25，STAT5，Foxp3等。

 

 

CD4   
                                                                             
                                                                                      

 表达量的强弱，可以参考厂家的质检结果，但更多地需要参考文献里具体细胞群体的表达。

 

第三步，了解实验所用流式细胞仪的配置信息，包括：流式细胞仪的激光器、检测通道和滤光片等。

 

上期提到：流式细胞仪是同时检测多种荧光的，这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道，来确认有哪些荧光素可以选择，这样可以在后期搭配的时候，尽量避免干扰。如果没有仪器的通道信息，是无法去确定哪些荧光素可供选择的。可以说，如果没有仪器通道信息，配色就是“无源之水，无本之木”。

 

通过仪器通道信息，确认可以选择哪些荧光素后，我们还需要了解荧光素的信息，确认这些荧光素的激发波长和发射波长、接收该荧光的滤光片等信息，是否和流式细胞仪的通道一致。

                                                                                                  ▲ 常见荧光基团信息

 

第四步，了解荧光素的强度。

 

下表列出了常见荧光素的强度：

 

在已确定Marker的强弱，和流式细胞仪可检测的荧光素的强弱后，我们要遵循“强弱搭配原则”，进行配色。

 

强表达抗原，可以选择弱荧光素，也可以选择强荧光素。

 

如下图所示，强表达抗原CD3，选择弱荧光素FITC或强荧光素APC，对实验结果影响不大。

 

弱表达抗原，一定要选择强荧光素。

 

如下图所示，弱表达的抗原CD25，选择弱荧光素PerCP，会导致阴阳性细胞群分不开。如果选择强荧光素PE，可以看到明显的阳性细胞群。

 

当然，有些老师在配色时，也会遇到一些其他的问题，如：细胞样本有自发荧光、细胞处理容易出现死细胞（需要额外增加死活细胞染料）等。因此，我们需要特别注意，将对应通道的荧光检测信息，预留给自发荧光，或者死活染料检测。

 

 

相信在了解了流式配色的基本原则及操作步骤后，大家的实验也能更加顺利地开展啦~