人外周血调节性T细胞鉴定方案

CD127 VS Foxp3

虽然Foxp3是目前公认的调节性T细胞最特异的指标，但因其位于细胞内，使得Foxp3的染色必须要固定细胞并破核膜，因此这种方法并不适用于分离活的Tregs，且该方法比较传统，操作相对复杂，稍有不慎就会影响实验结果。

而CD127属于细胞表面Marker，无需固定破膜。因此，当前主流方向是通过CD127来检测人Tregs。

CD127的发现

CD127是2006年被发现的一种检测CD4+CD25+调节性T细胞的新指标。由于不需要将细胞固定破膜处理，检测起来要比Foxp3方便。

研究发现，CD4+CD25+纯化的细胞中，CD127与Foxp3的表达呈负相关。通过CD4+CD127low纯化出的CD4+CD25+ T细胞，与Foxp3纯化的CD4+CD25+ T细胞数量相似，并且这部分细胞展现了CD4+CD25+调节性T细胞的典型特征。CD4+CD25+CD127-/low是较CD4+CD25+Foxp3+更优的特异性检测

配色方案

细胞亚群	种属	指标	荧光标记	克隆号
Treg	Human	CD45	EV450	HI30
		CD3	ER780	OKT3
		CD4	FITC	RPA-T4
		CD8a	PerCP/Cyanine5.5	OKT-8
		CD25	PE	BC96
		CD127	AF647	A019D5

 

人Treg鉴定所需流式抗体

产品名称	荧光素	货号	规格
CD45	EV450	E-AB-F1137Q	20T
CD3	ER780	E-AB-F1001S	20T
CD4	FITC	E-AB-F1109C	20T
CD8a	PerCP/Cyanine5.5	E-AB-F1110J	20T
CD25	PE	E-AB-F1194D	20T
CD127	AF647	E-AB-F1152M	20T

人Treg鉴定所需辅助试剂

作用	货号	名称	规格
细胞染色 缓冲液	E-CK-A107	Cell Staining Buffer	100mL
红细胞 裂解液	E-CK-A105	10×ACK Lysis Buffer	100mL

样本管设置

目的	样本	设置
调电压	1	Blank（空白管）
调补偿	2	CD45-EV450
	3	CD3-ER780
	4	CD4-FITC
	5	CD8a-PerCP/Cyanine5.5
	6	CD25-PE
	7	CD127-AF647
Full Panel	8	CD45-EV450、CD3-ER780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-AF647

实验步骤

01

在离心管内加入100μL新鲜血，与2mL 1×ACK红细胞裂解液混匀，4℃裂解10min；

02

300g离心5min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃掉上清，用移液枪轻轻吸走残液，可以得到白色的细胞沉淀；

03

加入100μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，与流式抗体混匀，4℃孵育30min；

04

加入2mL细胞染色缓冲液，300g离心5min，弃掉上清，再加入200μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；

05

上机进行检测。

实验结果

                                                                                                                                   人外周血Treg细胞表型分析

解析：

▶ 荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管，用于调节补偿；

▶ 本实验取正常人外周血验证，无生物学对照；

▶ 增加CD45指标，便于淋巴细胞圈门；

▶ 圈门路径：

第一步，根据CD45和SSC-H，圈出淋巴细胞群；

第二步，利用FSC-H和SSC-H，去黏连，得到单细胞；

第三步，通过CD3，确定CD3+ T细胞；

第四步，通过CD4和CD8，得到CD4+辅助T细胞；

第五步，通过CD25+CD127-/low，确定出Treg细胞亚群。