Annexin V常见问题分析及解决方案

不久前，我们发布了文章：从入门到精通：Annexin V凋亡实验超详细攻略（点击查看),给大家讲解了Annexin V实验中需要注意的一些小细节，好多同学跟咱们反馈说，这些细节问题我在实验的时候都注意了，但实验结果还是很不理想。

出现异常实验结果时，我们该怎么办呢？

直接丢掉这次数据重新实验吗？

No！No！No！

 

我们需要认真对待失败的实验数据，分析总结实验失败的可能原因，这样才能有针对性地重新实验，得到理想的实验结果。

本篇文章，我们将结合多年实验经验，为大家带来Annexin V的常见问题分析，通过实际案例，让大家更深入地了解Annexin V实验。

 

问题一:处理组晚期凋亡细胞分两群，缺少早期凋亡

 

可能原因：细胞处理条件太过剧烈，如：药物浓度过大、溶解药物的有机溶剂用量过大、极端条件（沸水等）处理细胞，导致细胞迅速死亡，呈现类似周期实验中细胞被固定的效果，缺少凋亡过程。

解决方案：温和处理细胞，如：降低药物浓度；有机溶剂（DMSO等）的量最好控制在5‰以下。

 

问题二： 缺少早期凋亡细胞，并且伴随大量坏死或裸核细胞

可能原因：药物处理时间过长，不耐药细胞凋亡后转向裸核，耐药细胞不再发生凋亡。

解决方案: 缩短药物处理时间（为保证凋亡效果，可以适当增加药物处理的剂量）。
 

问题三 : 核染（PI/7-AAD/DAPI）,无阳性信号

 

可能原因		解决方案
①核染料忘记添加		①重新实验，注意添加核染料
②试剂保存不当而失效，如7-AAD没在-20℃下保存		②重新购买试剂，注意试剂的保存条件
③细胞确实没有凋亡		③重新调整细胞处理条件，可以借助显微镜观察细胞是否凋亡
④阈值设置过大，凋亡信号没有收集到		④调整仪器设置，降低阈值
⑤贴壁细胞培养液上清中的细胞没有收集		⑤重新实验，注意收集上清中的细胞

 

问题四: 分群不明显

可能原因		解决方案
①细胞带自发荧光		①更换其他标记的试剂盒
②细胞凋亡过多导致染料不足		②增加染料用量
③细胞状态较差，所有细胞都有一定的PS外翻		③培养、实验过程都需要温柔对待细胞

 

问题五:空白组有荧光信号

 

可能原因		解决方案
①流式细胞仪没有清洗干净		①彻底清洗仪器
②荧光物质（如：阿霉素、四环素、细胞转染了带荧光的质粒等）干扰		②更换其他荧光标记的试剂盒，或者用其他物质培养细胞
③凋亡或者坏死的本底荧光		③空白组应选用状态良好的正常细胞，如细胞状态过差无法恢复或存在污染，应及时更换细胞
④细胞不纯

 

问题六 正常细胞出现大量凋亡

 

可能原因		解决方案
①细胞状态不佳		①调整细胞状态，重新培养细胞
②实验操作时手法粗暴，或细胞消化过度		②温柔对待细胞
③孵育时间过长，长时间处于非正常生长环境会导致细胞凋亡		③控制好实验的时间，如果样本太多，可以分批进行实验
④Binding Buffer稀释的问题：buffer未正确稀释，溶液渗透压异常导致细胞凋亡		④按照说明书要求进行操作

当然，好的结果都是都是一样的好，不好的结果各有各的不好，咱们目前列举了一些常见的异常情况，希望对大家的实验有帮助~

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