Elabscience_JC-1实验常见问题及解决方案

在细胞凋亡的过程中往往伴随着线粒体膜电位的降低，这被广泛认为是细胞凋亡过程中最早发生的事件之一。线粒体膜电位的检测有很多方法，JC-1是其中最为常见的一种，今天我们就来聊聊JC-1的那些事。
 

检测原理

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位∆Ψm的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。JC-1有单体和多聚体两种存在形式，两者发射光谱不同。在正常细胞内，线粒体膜电位较高，JC-1以多聚体形式存在于线粒体的基质中，产生红色荧光；凋亡早期，线粒体膜电位降低，JC-1以单体形式存在于线粒体基质中，产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可反映细胞线粒体膜电位的下降，因此可将JC-1荧光颜色的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。

 

                                                                图1：JC-1实验原理

 

Elabscience^®线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)实验结果
 

如下图所示：用线粒体膜电位检测试剂盒（E-CK-A301）进行检测，结果显示正常细胞存在少量凋亡，表现为出现少量线粒体膜电位崩塌细胞；CCCP处理的阳性对照几乎所有细胞线粒体膜电位崩塌；实验组细胞出现大量线粒体膜电位崩塌细胞。

 

图2：JC-1实验结果

◇正常组：正常培养的Jurkat细胞

◇阳性对照：正常培养的Jurkat细胞，用10 μM的CCCP处理20 min

◇实验组：2.5 μM喜树碱处理24 h的Jurkat细胞

 

实验常见问题及解决方案

 

Q1 JC-1工作液中存在红色的絮状小结晶

原因1：配制JC-1工作液的时候没有按照说明书的顺序操作。

解决方案1：配制JC-1工作液需要严格按照说明书进行操作，先用纯水稀释JC-1（500×），再加JC-1 Assay Buffer。

 

原因2：JC-1没有溶解好，因为JC-1在水中溶解度较小。

解决方案2：37℃水浴或超声促进溶解。

 

Q2 贴壁细胞怎么检测JC-1?

可以根据实验室仪器来决定，如果实验室有流式细胞仪，可以将贴壁细胞消化下来（注意收集培养上清中的因凋亡而脱落的细胞），参考悬浮细胞的实验流程来进行实验。如果实验室只有荧光显微镜，可以按照说明书的步骤操作。

 

Q3 组织样本可不可以用JC-1检测凋亡？

可以，但无法直接检测组织，可先将组织制备成单细胞悬液，再按照悬浮细胞的操作步骤来检测，另外需注意制备单细胞悬液的过程易对细胞造成损伤，需对制备方案进行摸索，避免因消化细胞引起线粒体膜电位变化而导致假阳性；也可提取组织中的线粒体（推荐使用Elabscience^®线粒体提取试剂盒E-BC-E001），再孵育JC-1，用荧光酶标仪检测实验结果。

 

Q4 贴壁细胞能否直接用JC-1在6孔板染色后，再用胰酶消化下来上流式？

不建议，贴壁细胞之间相互接触可能会导致细胞与染料接触不均一，对JC-1染料进入细胞造成影响，尤其是当细胞生长较为密集的时候。推荐消化细胞后再孵育JC-1。

 

Q5 石蜡切片和冰冻切片可以做JC-1吗？

不可以，JC-1实验的样本必须是活细胞。

 

Q6 JC-1孵育完成后不能及时检测，可以固定后再检测吗？

不可以，JC-1用于活细胞样本的检测，固定后细胞死亡；此外，染色后放置过久会导致荧光淬灭，建议染色30 min内完成检测。