免疫细胞 | NK细胞简介及指标选择

免疫系统就像是人体的护卫队，默默地守护着我们的健康。而组成这支护卫队的则是免疫细胞，它们一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能；另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，为健康奠定基础，是“人体最\好的医生”。

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                                                            图1. 免疫系统的成员

NK细胞、T细胞、B细胞等都属于免疫系统的成员，在之前的流式课堂中，我们介绍了Th1/Th2/Th17和Treg细胞及其指标选择，今天给大家简要介绍NK细胞，并讲解其检测指标及实例分析。

1 NK细胞简介

NK细胞是淋巴细胞中的一员，又称自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞），是机体内重要的免疫细胞。NK细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，约占血液中所有免疫细胞（白细胞）数量的15%，属于天然免疫系统的核心细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏。它无需抗原预先致敏就能破坏靶细胞，且无MHC限制性，应答速度快，在免疫应答的早期即可发挥作用。

                                                                  图2. NK细胞示意图

NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。并且，在面对癌细胞时，NK细胞不需要其他细胞的激活与致敏，便能直接识别并杀死癌细胞，因此，也被称为人体抗癌第一道防线。如果NK细胞数量减少或功能下降，机体发生肿瘤性疾病的机会明显增高。

■ 与同属先天性免疫细胞家族的中性粒细胞、巨噬细胞等相比，其清除细菌、抵御病毒的范围更加广泛。

■ 与获得性免疫细胞T细胞相比，其在预见“敌人”入侵这件事上反应更加灵敏，同时“杀敌”更广谱，不仅限于杀伤肿瘤细胞，更在抵御病毒、抗衰老上有所建树。
 

2 NK细胞的发育和分类

目前主流的NK细胞发育模型认为，NK细胞来源于骨髓中的CD34⁺CD45RA⁺造血祖细胞（HPCs）。在骨髓中，NK细胞由HPCs通过常见的淋巴样祖细胞（CLPs）和NK细胞前体（NKPs）发展而来，然后迁移到外周血（Conventional NK cells，cNK细胞）或组织（tissue-resident NK cells，trNK细胞）。

trNK细胞的分化发生在不同的组织部位，包括肺、胸腺、肝脏、子宫、皮肤、皮下脂肪组织和肾脏。在这些位点，NK细胞具有不同的表型特征和功能，构成了NK细胞在不同成熟阶段的循环。除了不同的组织类型外，即使在同一器官和同一组织中，NK细胞也具有高度的异质性。

                                                         图3. NK细胞的发育和亚群

NK细胞常被定义为CD3^‒CD56⁺细胞，通常根据表面蛋白CD56和CD16的相对表达分为两类：CD56^hiCD16^-（免疫调节，细胞因子产生）和CD56^lowCD16⁺（细胞毒性）。其中，CD56^lowCD16⁺占全部NK细胞的90%，CD56^hiCD16^-/low只占约10%。
 

3 NK细胞检测指标选择及案例

要检测NK细胞，应当如何选择指标呢？根据过往的实验经验，为大家进行了如下总结：

■ Human：CD3^-CD56⁺CD16⁺

■ Mouse：CD3^-CD49b⁺/NK1.1⁺

人外周血NK细胞检测案例

人的NK细胞在发育的过程中表达出特异性的指标CD56，也有部分NK细胞表达FcγRIIIA（CD16），发育终末还会表达CD57。外周血或其他非纯化NK细胞的样本，检测时还要加上CD3同时检测，以排除一类特殊T细胞——NKT（CD3⁺CD56⁺）。人外周血NK细胞检测结果如下图所示：

图4. 人外周血NK细胞检测流式结果图

① NK细胞的检测标准是CD3^-CD16⁺CD56⁺。

② CD16和CD56最好要有同型对照，其它指标因分群明显可以省去。

③ 人外周血样本建议染CD45，通过CD45与SSC，有利于淋巴细胞圈门。可以利用CD45的单染管，低速上机，设置阈值。

C57BL/6小鼠NK细胞检测案例

CD49b和NK1.1是小鼠NK细胞鉴定的两个标志物，实验时，需要根据小鼠品系从中选择一个。例如，BALB/c小鼠用CD49b（DX5），C57BL/6小鼠用NK1.1，分析时圈CD3^-CD49b⁺或者CD3^-NK1.1⁺。C57BL/6小鼠NK细胞检测结果如下图所示：

                                                 图5. C57BL/6小鼠NK细胞检测流式结果图

① 外周血样本增加CD45指标，直接通过CD45和SSC圈出淋巴细胞群。

② C57BL/6小鼠NK细胞的检测标准是CD3^-NK1.1⁺。

③ 该实验的关键因素为红细胞裂解，红细胞裂解过度或者裂解不足，均会导致淋巴细胞群分群不明显。

 

4 NK细胞检测流式抗体推荐

种属	指标	克隆号	荧光素	货号
Human	CD45	PerCP	HI30	E-AB-F1137F
	CD3	PE/Cyanine7	OKT-3	E-AB-F1001H
	CD16	PE	3G8	E-AB-F1236D
	CD56	PE	5.1H11	E-AB-F1239D
	Mouse IgG1, κ Isotype Control	PE	MOPC-21	E-AB-F09792D
Mouse	CD45	Elab Fluor® Red 780	30-F11	E-AB-F1136S
	CD3	FITC	17A2	E-AB-F1013C
	NK1.1	APC	PK136	E-AB-F0987E
	Mouse IgG2a, κ Isotype Control	APC	C1.18.4	E-AB-F09802E

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