上期推文带来了流式配色原则第一课：强弱搭配（点击查看）。今天继续为大家介绍多色流式配色六大法则中的第二条——弱表达抗原放在无干扰通道，强表达抗原放在不干扰其它通道的通道，指的是配色时要注意避免对弱表达抗原的荧光干扰及强表达抗原对其它指标的荧光干扰。

 

说到荧光干扰，就得说下什么是荧光溢漏。荧光溢漏是指荧光染料的信号溢出到其它的通道，这是由荧光染料发射和仪器光学设置产生的问题。荧光溢漏的原因分三点：

 

01 一是由于荧光染料的发射光谱比较宽，不同的荧光染料会有光谱重叠现象，所以荧光之间会存在干扰。例如，FITC和PE由488 nm激光器激发时，FITC的发射光谱有一个长长的尾巴，会进入到PE通道，被PE通道接收。所以我们接收到PE通道的信号，除了有PE通道本身的信号之外，还有FITC溢漏进去的信号。

                                                  图1. 荧光光谱重叠

02 二是串联染料，串联荧光染料由两种荧光素联接在一起，其发光原理利用了荧光共振能量转移现象。供方荧光素如PE、APC被激发，然后通过共振将能量转移给受体荧光素，例如PE-Cyanine7和APC-Cyanine7中的Cyanine 7。PE-Cyanine7的激发原理是由流式细胞仪的激光器首先激发PE，再由PE的发射光激发Cyanine7，这个时候，PE的发射光就会有一部分进入PE通道，被PE通道接收,从而干扰PE通道的信号。

                                                   图2. 串联染料荧光干扰

03 三是多激光激发，如PE-Cyanine5、Cyanine5可以被PE的发射光激发，也可以被APC的激发光激发，产生的信号干扰APC通道的信号，所以Cyanine5不能与APC同时使用。

                                                图3. 多激光激发荧光干扰

 

做多色流式实验的时候需要通过补偿调节，消除光谱重叠的影响。但是，通过补偿仅能消除荧光背景，被干扰通道的荧光灵敏度降低的问题无法消除。

                                                       图4. 荧光干扰的影响

 

为了避免荧光干扰对指标检测的影响，在多色配色时我们需要注意：

 

01 将弱表达抗原放在无干扰通道，无干扰通道不会受到其他通道的干扰，比如FITC通道就是无干扰通道。

02 强表达抗原放在不干扰其它通道的通道，比如做人外周血多色时需要检测CD45，CD45的表达量一般来说非常高，容易影响弱表达抗原的检测，我们可以将CD45搭配Elab Fluor^® Violet 450 （Percific Blue通道），这样就不会对488 nm或者633 nm激光器激发的染料产生干扰。

 

以上就是关于流式配色原则中“荧光干扰”的解读，下期流式课堂将为大家带来流式配色原则第三课——互斥抗原的讲解，请持续关注Elabscience^®！