1.基本信息

英文标题：Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation（链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41892-5 复制至浏览器，点击查看原文）

中文标题：靶向蛋白质-DNA相互作用及液液相分离的cGAS环肽抑制剂研究

发表期刊：Nature Communications

影响因子：16.6

第一作者单位：北京大学

通讯作者单位：北京大学

使用Elabscience^®的产品

产品名称	产品货号
Annexin V-FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒	E-CK-A211

 

2.研究背景

cGAS-STING信号通路是天然免疫系统的重要组成部分。cGAS在先天免疫和自身炎症反应及诱导细胞死亡和细胞自噬中的重要作用，支持cGAS作为cGAS活性异常相关疾病的潜在药物靶点。越来越多的证据表明，cGAS-STING通路的激活会诱导细胞死亡和细胞自噬的发生，特异性阻断cGAS活性可能对DNA诱导的细胞死亡和细胞自噬发挥抑制作用。

近年来，人们致力于开发强效和特异性cGAS抑制剂，靶向cGAS活性位点的多种化学支架的cGAS抑制剂已通过高通量筛选试验发现，并通过药物化学进行了优化。鉴于cGAS在DNA诱导的细胞死亡和细胞自噬中的重要作用，cGAS抑制剂对DNA诱导的细胞死亡和细胞自噬的特异性抑制效应,可能是开发有效的cGAS抑制剂的重要指标。另外，与传统的蛋白质配体结合口袋不同，蛋白质-DNA界面的溶剂暴露、高正电荷和平坦的特性使开发具有类药物性质的小分子抑制剂具有挑战性。因此，开发靶向调节蛋白质-DNA界面cGAS抑制剂可能为突破现有cGAS抑制剂临床应用的局限性提供新的思路。  

 

3.技术方法

本文采用了多种实验技术方法，包括流式细胞术、组织学染色、WB、qPCR、荧光偏振、微量热泳动、表面等离子共振、免疫荧光、ELISA等。首先，研究人员通过靶向PPIs（蛋白质-蛋白质相互作用）环肽库的体外筛选，鉴定出一类新型cGAS环肽抑制剂，通过分子模拟、体外生化实验以及细胞实验验证了该抑制剂靶向cGAS和dsDNA之间的蛋白质-DNA界面，破坏dsDNA和cGAS之间的相互作用，抑制cGAS的活化。之后，本文进一步利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（E-CK-A211）,验证了该类环肽抑制剂通过阻断cGAS活化，并进一步抑制DNA诱导的细胞死亡。

 

4.技术路线

01 从体外大环肽库中筛选cGAS抑制剂

02 体外验证环肽化合物与cGAS结合作用机制

03 体外验证环肽化合物抑制DNA诱导的cGAS液相缩合

04 通过人源和鼠源细胞中验证环肽化合物的cGAS抑制效力和特异性，并通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（E-CK-A211）验证了环肽化合物抑制cGAS活性介导的细胞死亡

05 在Trex1^-/-小鼠中，验证环肽化合物减轻小鼠的全身炎症

 

5.研究结果

                                      图1. XQ2与cGAS结合并阻断cGAS-DNA相互作用

为了从大环肽库中筛选靶向蛋白质-DNA界面的cGAS抑制剂，本文应用了一种基于RNA的荧光生物传感器来检测2'，3'-cGAMP，用于体外筛选cGAS活性抑制剂，并通过细胞实验进一步筛选验证。在体外蛋白水平和细胞水平测定中苗头分子（hits）之间的抑制活性差异，可能归因于它们不同的细胞渗透性，本文鉴定结果表明，XQ2在细胞测定中具有最佳cGAS抑制活性，并进一步验证了XQ2特异性抑制人源和鼠源细胞中dsDNA诱导的cGAS活化和cGAS-STING信号传导。接下来，本研究在体外通过表面等离子体共振（SPR）、微量热泳动（MST）以及荧光偏振（FP）等技术分析表明XQ2与cGAS直接结合，并阻断cGAS与DNA的相互作用。本研究进一步结合分子对接及定点突变，阐明XQ2与cGAS的潜在结合模式。

                                    图2. XQ2抑制DNA诱导的cGAS液液相分离

DNA诱导的cGAS液液相分离（LLPS）在调节酶活性和先天免疫信号传导中起着至关重要的作用。鉴于XQ2对dsDNA与cGAS结合的抑制作用，本研究进一步在体外蛋白水平和细胞水平验证了XQ2以剂量依赖的方式，有效抑制DNA诱导的cGAS液液相分离。

                                     图3. XQ2B抑制cGAS诱导的细胞死亡

越来越多的证据表明，cGAS活化诱导的下游信号触发细胞死亡和细胞自噬，因此抑制cGAS活性可能对于DNA诱导的细胞死亡发挥抑制效应。本文利用Jurkat细胞，用DMSO或XQ2B处理，然后用ISD（45bp DNA）刺激4小时，通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（E-CK-A211）评估细胞死亡（结果如图3所示）。通过流式细胞术分析实验验证了该类环肽化合物抑制DNA诱导的细胞死亡，显示出该类环肽抑制剂对cGAS活性及其下游信号抑制的效应。

                                     图4. XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎症

为了评估XQ2B的临床应用价值，本文利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠，进一步验证了XQ2B显著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬细胞中I型干扰素和促炎细胞因子的表达水平，以及Trex1^-/-小鼠的全身炎症，表明XQ2B有效地减轻了Trex1^-/-小鼠的全身炎症，突出了靶向蛋白质-DNA界面的cGAS特异性抑制剂在cGAS相关自身免疫性疾病中的治疗潜力。

 

6.总结

总之，这项研究通过体外生化实验、分子模拟、细胞实验和动物实验等技术手段，成功鉴定出一类全新作用机制的cGAS环肽类抑制剂，靶向蛋白质-DNA界面，并阻断DNA诱导的cGAS液相缩合和活化。通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（E-CK-A211）验证了该类环肽抑制剂通过阻断cGAS活化并进一步抑制DNA诱导的细胞死亡。此外，该类环肽抑制剂显著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬细胞中I型干扰素和促炎细胞因子水平以及Trex1-/-小鼠的全身炎症。XQ2B作为首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分离的特异性cGAS抑制剂，为进一步开发cGAS相关自身免疫性和自身炎症性疾病药物提供新的思路。

以上是一作王老师为我们分享的实验设计解读。