Elabscience 细胞代谢 | 线粒体检测秘籍，形态、功能全搞定

线粒体，作为细胞的“动力引擎”，不仅是细胞能量生产的核心，还参与物质代谢、细胞信号转导等多种关键过程。线粒体功能的异常与多种疾病密切相关，如神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等。因此，准确检测线粒体的形态和功能，对于疾病诊断、药物研发和健康管理具有重要意义。

本期推文，小E将带您深入了解线粒体形态以及功能检测的关键指标，如膜电位、线粒体复合物、耗氧量、三磷酸腺苷（ATP）等及其应用方法，助您在科研中更好地评估线粒体健康状态。

线粒体形态检测

线粒体形态的变化与线粒体功能密切相关，通常我们可以通过显微镜来观察其二维形态和数量。电子显微镜则是观察和分析线粒体结构的“金标准”^[1]。此外，宽视野荧光显微镜和高分辨率共聚焦激光扫描显微镜能够提供线粒体形态变化的成像分析，且特异性高于电子显微镜。同时，通过使用特定的染料标记线粒体，结合免疫荧光染色技术和计算机图像处理，能够更清晰地可视化线粒体的形态。

线粒体功能检测

线粒体的功能是细胞活动的基础，它的功能除物质转化以外，最终体现在能量转换上。在评估线粒体功能时，通常会检测活性氧（ROS）水平、线粒体呼吸链复合物、耗氧量、ATP、膜电位、钙离子浓度、膜通透性转换孔等一系列指标。接下来，我们将针对上述关键指标的检测方法做重点介绍。

1 膜电位检测

线粒体膜电位（MMP）对维持细胞动态平衡至关重要。即使是MMP的微小变化，也可能显著影响线粒体的功能^[2]。当MMP发生异常波动时，可能会引发一系列线粒体相关疾病。因此，监测MMP是评估线粒体健康状态的一个重要手段。

JC-1是一种广泛应用于检测MMP的阳离子型亲脂性荧光探针，其灵敏度高于早期使用的Rhodamine 123。当MMP较低时，JC-1以单体形式存在，产生绿色荧光；而在MMP较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合体JC-1，产生红色荧光。通过使用荧光显微镜或流式细胞仪观察这些颜色变化，科学家们能够定量分析线粒体膜电位的变化，从而评估线粒体的功能状态。

 

图1为使用JC-1试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡膜电位变化。

结果：正常细胞（左）存在少量凋亡，表现为出现少量线粒体膜电位崩塌细胞；诱导凋亡细胞（中，2.5μM喜树碱处理Jurkat细胞24h）出现大量线粒体膜电位崩塌细胞；CCCP处理细胞（右，阳性对照）几乎所有细胞线粒体膜电位崩塌。

 

2 线粒体呼吸链复合物活性检测

线粒体呼吸链位于线粒体内膜上，由5个复合物组成：复合物I（NADH-Q氧化还原酶）、复合物II（琥珀酸-Q氧化还原酶）、复合物III（UQ-细胞色素C氧化还原酶）、复合物IV（细胞色素C氧化酶）和复合物V（ATP合成酶）。其通过一系列的氧化还原过程最终形成ATP。线粒体呼吸链复合物酶活力的高低，既反映了ATP生成的能力，也反映出细胞活力。

常用的线粒体呼吸链复合物检测方法有分光光度法、蛋白质印迹法、近红外光谱技术等。其中，分光光度法是评估复合物I-V活性的主要技术。为了比较不同细胞或组织中线粒体呼吸链复合物的活性，需同时测量柠檬酸循环中柠檬酸合酶的活性作为对照。

具体而言，复合物I和V的活性与NADH的氧化速率成正比，可通过测量NADH在340 nm处的吸光度来确定。复合体II催化琥珀酸氧化，以2,6-二氯靛酚（2,6-dichlorophenol indophenols, DCPIP）为底物，可通过测定底物氧化后600 nm处吸光度确定复合体II的活性。而复合体III和IV则可以通过测量细胞色素在550 nm处的吸光度来确定其活性。

图2. CHO细胞线粒体复合物检测结果

 

 

3 耗氧率检测

线粒体是细胞内耗氧最多的细胞器。通过实时监控细胞中的线粒体呼吸耗氧率（OCR），可以有效评估线粒体的氧化磷酸化效率及能量代谢状态。OCR降低通常指示线粒体ATP合成受损或存在功能障碍，而OCR的升高则表明细胞活动旺盛且代谢速率加快。这种方法广泛应用于药物筛选、疾病模型研究以及细胞代谢状态的评估。

传统的氧电极极谱法虽然能够检测线粒体耗氧量，但操作较为复杂。近年来，随着技术的进步，多种自动或半自动化的线粒体功能分析仪问世，但由于仪器价格较高，仍未完全普及。为了解决这一问题，开发者推出了可在荧光酶标仪上检测OCR的试剂，为研究者提供了更便捷、经济的解决方案。

 

图3. Hela细胞OCR检测结果

图3为使用OCR试剂盒检测2μM FCCP和0.5μM AntimycinA处理的Hela细胞。

结果：FCCP处理后OCR增加，AntimycinA处理后OCR降低。

 

4 ATP含量检测

ATP通常被认为是细胞的主要能量来源，而线粒体是ATP的主要生产场所。线粒体对外界环境刺激非常敏感，一旦受损会导致ATP生成减少，进而抑制多种细胞代谢过程，最终可能引发各种疾病。例如，帕金森病、心血管疾病和内分泌功能障碍等均与线粒体ATP产量下降密切相关^[3,4]。因此，ATP水平是评估细胞能量代谢和线粒体功能的关键指标。

测量ATP水平需要新鲜提取的线粒体样品，以保证线粒体的完整性和连接状态^[5]。目前常用的技术包括经典层析法、高效液相色谱法、酶分析法和荧光检测法等。其中，荧光素–荧光素酶测定法是一种被广泛使用的方法，其检测灵敏度能到达nmol甚至更低。

 

图4. Jurkat细胞ATP/ADP检测结果

图4为使用ATP/ADP检测试剂盒检测Camptothecin处理后的Jurkat细胞变化。

结果：Camptothecin处理后ATP/ADP比值降低。

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参考文献

[1] Granata, C., Jamnick, N.A. and Bishop, D.J. Training-Induced Changes in Mitochondrial Content and Respiratory Function in Human Skeletal Muscle. Sports Medicine, 2018, 48, 1809-1828.

[2] Chen LB. Mitochondrial membrane potential in living cells. Annu Rev Cell Biol, 1988, 4: 155-181.

[3] Lee, P., Chandel, N.S. and Simon, M.C. Cellular Adaptation to Hypoxia through Hypoxia Inducible Factors and Beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21, 268-283.

[4] 张鑫, 黎萍, 王钰涵, 等. 血管性痴呆认知功能障碍与海马线粒体功能异常的机制研究进展[J]. 中国全科医学, 2022, 25(23): 2910-2916.

[5] Schönfeld, P. and Wojtczak, L. Short- and Medium-Chain Fatty Acids in Energy Metabolism: The Cellular Perspective. Journal of Lipid Research, 2016, 57, 943-954.