Elabscience 解密流式实验：死细胞才是高背景 “元凶”，这样破解超高效！

您的流式图是不是经常荧光乱飘、细胞分群像打了马赛克、阳性阴性傻傻分不清？这可能不是手抖，也不是抗体选错，而是忽略了潜伏在实验中的“干扰大师”——死细胞。

没错，就是这些看似无害的死细胞，正在悄悄搅乱您的数据！不过别慌，今天Elabscience来帮您厘清死细胞对流式实验的影响，为您提供清晰、有效的破解之道！ 

 

死细胞对流式实验会造成哪些影响？

1. 非特异性结合：死细胞的细胞膜通透性增加，完整性受损。它们会像一块“小海绵”非特异性地结合抗体和荧光素，导致结果出现非特异性染色，显著抬高荧光背景。这样会导致目标阳性群信号被淹没在一片高背景中，实验结果假阳性率升高，细胞分群模糊不清。

 

Fig. 1. 相同样本排除死细胞前后结果对比（A组未加死活染料染色，B组加入PI染料进行染色）

2. 自发荧光干扰：死细胞会导致背景自发荧光增强，其信号强度甚至可能超过某些荧光素的真实信号。这对于弱表达抗原或不分群指标的检测结果会有较大的影响。并且死细胞产生的荧光波长没有选择性，可被多个通道检测，在有的图上会表现为沿对角线分布的信号。这也是识别死细胞干扰的一个重要特征。

 

Fig. 2. 死细胞干扰特征示意图。死细胞在图上沿对角线分布（Dead cells）

如何有效去除死细胞的影响？

排除死细胞的关键是使用死活细胞鉴定染料。目前主要的死活鉴定染料分为核酸染料和胺基染料，它们的原理不同，适用场景各异。

1. 核酸染料（适用于未固定样本）

该方法的原理基于活细胞膜的完整性：活细胞因膜结构保持完整，具有选择透过性，使得PI、7-AAD、DAPI这类核染料无法进入细胞内部，因此不会显现荧光；而死细胞由于膜已破损，染料可进入细胞内并与核酸结合，从而发出荧光。使用时，在完成流式抗体染色后，于上机前加入核酸染料并进行短暂孵育。

需要注意的是：若实验后续需进行固定处理，固定过程会破坏所有细胞的膜结构，导致活细胞亦呈阳性信号，故此方法在后续要进行固定处理的情况下不适用。

2. 胺基染料（适用于需固定的实验）

该方法的原理是通过染料与蛋白质伯氨基的共价结合实现的：活细胞因仅与细胞膜表面蛋白结合，荧光信号较弱；而死细胞由于细胞膜破损，染料可结合胞内大量蛋白，因此荧光信号较强。使用时，在流式抗体染色前进行死活细胞染色，清洗后细胞可继续进行固定和破膜操作，且其荧光信号不会丢失。

不同样本如何选择？

并非所有样本都必须要进行死活染色。根据我们的经验，为您提供以下实操建议：

1. 新鲜外周血/骨髓样本：一般死细胞较少，可以不做。但若不太新鲜或处理不当，仍建议染色。

2. 脾脏/淋巴结等组织：样本制备难度相对容易，可根据单细胞悬液的质量决定。若镜下可见较多碎片，建议进行染色。

3. 难制备的组织/肿瘤样本：死细胞通常特别多，建议一定要做！

4. 多色流式实验：建议进行死活染色。这是降低背景、提高数据质量的关键步骤，需注意染料通道与抗体panel的兼容性。

产品推荐

我们可提供多种核酸染料及胺基染料，全面满足您从基础表面标记到复杂多色胞内染色的各类需求。

产品名称	货号	产品规格	用途
碘化丙啶(PI)染色液	E-CK-A161	50/100/200/500 T	细胞内DNA染色
7-氨基放-线菌素D(7-AAD)染色液	E-CK-A162	50/100/200/500 T	细胞内DNA染色
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸-盐(DAPI)染色液	E-CK-A163	50/100/200/500 T	细胞内DNA染色
STYX™ Green Fixable Viability Kit	E-CK-A166	50/100/200 T	鉴定细胞死活状态，区分死活细胞
STYX™ Violet Fixable Viability Kit	E-CK-A167	50/100/200 T	鉴定细胞死活状态，区分死活细胞

 

是不是没想到，小小的死细胞，竟有这么大的破坏力？下次做流式实验，记得正确使用死活染料，获得高质量、可重复流式数据！

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