Elabscience实操攻略：人PBMCs/CD3+T/Pan Naive T细胞20天长期培养与动态分析

前言

研究表明，T细胞经快速激活后需立即转入长期培养阶段。T细胞长期培养是连接基础免疫学研究与临床转化应用的关键技术平台，该体系通过模拟体内慢性刺激微环境，可动态追踪T细胞从初始状态向效应态、记忆态或耗竭态演变的连续轨迹，为深入探索并精准解析T细胞命运决定的分子开关（如TCF-1、TOX）提供理想工具。

同时，借助优化的细胞因子组合（如 IL-2/IL-7/IL-15）及代谢调控策略，可规模化富集干细胞样记忆T细胞（TSCM）等“干性”亚群，为新一代细胞疗法的开发提供优质种子细胞。

上篇推文中已详细介绍T细胞长期培养的关键起始步骤——体外快速激活的核心策略与技术要点。本期推文Elabscience小E将为大家介绍T细胞长期培养实验方案及相关技术要点，包括更换含 IL-2/IL-7/IL-15 的低刺激强度培养基、维持3-4周动态传代等核心操作；培养期间，需定期检测T细胞表型标志物（CD62L、CD45RA、CD45RO、PD-1、CD95、CD197）、功能效应特征（IFN-γ分泌水平、增殖能力）及线粒体活性，以实时评估细胞干性维持状态与耗竭进展。

本次重点对比分析人外周血单个核细胞（PBMCs）、阴性分选的人外周血 CD3+T细胞及阴性分选的人外周血Pan Naive T细胞，在仅含 IL-2（无 IL-7+IL-15）的单细胞因子培养基中培养20 d的增殖状态、细胞表型变化，及短期培养内的细胞代谢特征，期望能为各位老师的实验提供参考。

一、实验结果展示

1.1 T细胞长期培养表型检测和代谢功能检测

图1. T细胞长期培养状态和功能检测。（A）人外周血分离 PBMCs，CD3/CD28 磁珠激活5 d去磁珠，培养至20 d，检测CD4/CD8比值及T细胞亚群（TN、TCM、TEM、TEMRA、TSCM）分布。（B）人外周血分选CD3+T细胞，同（A）方法培养20 d，检测CD4/CD8比值及上述亚群比例。（C）人外周血分选Pan Naive T细胞，同（A）方法培养20 d，检测CD4/CD8 比值及目标亚群比例。（D、E）三种初始 T 细胞0-20 d增殖动力学及20 d凋亡水平检测，无 IL-7和IL-15活性单边的细胞培养基中，三种细胞的增殖数目均在第12 d显著下降。（F）记忆T细胞（Tmem）与初始T细胞（Tnaive）葡萄糖摄取能力比较，记忆T细胞群糖摄取能力高于初始T细胞。（G）人外周血分选出CD3+T细胞，CD3/CD28磁珠激活3 d，与对照组比较细胞内ATP代谢水平，激活后ATP显著升高。（H）人外周血分选CD4+Tnaive和CD4+Tmem 细胞，检测细胞的胞外酸化率（ECAR），CD4+Tmem 细胞糖酵解水平更高。（I）人外周血分选CD4+Tnaive和CD4+Tmem 细胞，检测细胞的氧消耗速率（OCR），CD4+Tmem 细胞线粒体呼吸显著低于CD4+Tnaive细胞。

结果分析

• 在缺乏IL-7和IL-15的培养基中，三种细胞的增殖数量均于培养第12 d显著下降。
• PBMCs培养过程中，CD4/CD8比值呈逐渐下降趋势，干细胞样记忆T细胞（TSCM）与效应记忆 T 细胞（TEM）比例逐步升高，于第20 d达峰值；其中 CD8+TSCM细胞比例显著高于CD4+TSCM，CD4+TEM 比例显著高于CD8+TEM，而CD8+终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）比例明显高于CD4+TEMRA。
• 以阴性分选的人外周血CD3+T 细胞为初始细胞，CD4/CD8比值在培养第5-7 d显著升高后逐步下降，TSCM与中央记忆T细胞（TCM）比例持续上升并于第20 d达峰值；其中CD4+TSCM细胞比例略高于CD8+TSCM，CD4+TEM比例显著高于CD8+TEM，CD8+TEMRA比例显著高于CD4+TEMRA。
• 以阴性分选的人外周血Pan Naive T 细胞为初始细胞，CD4/CD8比值在培养第2 d下降后持续升高，于第20 d达最大值；增殖过程中TSCM 比例变化不显著，细胞亚群中以TCM占比最高。

 

1.2 T细胞其他激活培养场景细胞因子分泌功能检测

图2. ELISPOT检测T细胞功能。将PBMC在不含或含刺激剂Anti-CD3 mAb（500 ng/mL）的条件下孵育20 h，ELISPOT检测T细胞相关因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A的表达。

图3. 人PBMC细胞（1×10⁶ Cells/mL）未经处理或用10 μg/mL PHA +10 ng/mL PMA或用PMA(50 ng/mL)+ Ionomycin (500 ng/mL)刺激培养1天，ELISA测定细胞培养上清液IFN-γ/IL-2/IL-4/IL-17A含量。

二、实验操作流程

2.1 试剂配制和准备

• T细胞激活培养基：10% FBS+1×L-谷氨酰胺（2 mM）+1×青霉素-链霉素-新霉素（PSN）的RPMI-1640基础培养基。
• T细胞长期培养培养基：IL-2（50 U/mL）+10% FBS+1×L-谷氨酰胺（2 mM）+1×青霉素-链霉素-新霉素（PSN）的RPMI-1640基础培养基（本次不添加 IL-7和IL-15）。

2.2 细胞分选流程

• 取新鲜的人外周血，分选出PBMC细胞，详细操作流程见Human PBMC Separation Solution(P 1.077)（E-CK-A103）产品说明书。
• 取新鲜的人外周血，分选出PBMC细胞，使用EasySort™ Human CD3+T Cell Isolation Kit（MIH001N）和EasySort™ Human Naïve Pan T Cell Isolation Kit（MIH006N）分选出CD3+T细胞和Pan Naive T细胞，详细操作流程可参考产品说明书。

2.3 细胞快速激活和长期培养流程

• 分选出的细胞使用T细胞激活培养基重悬，细胞计数，150-300×g，离心3分钟，弃上清。
• 使用T细胞激活培养基重现细胞沉淀，调整细胞密度到1×10⁶/mL。
• 按照细胞数目取合适体积的Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads（MIH001A），加入1 mL的T细胞激活培养基，磁吸洗涤1次，重悬后与细胞共孵育，37℃、5% CO₂培养24小时完成初始激活（详细步骤可参考产品说明书）。
• 24 h后补充二分之一激活培养基，继续激活培养48-96 h后，磁吸去除激活微球。

激活结束后，使用T细胞长期培养培养基（IL-2单因子维持培养基）重悬细胞，调整细胞密度到5×10⁵/mL，37℃、5% CO₂培养，每日观察细胞状态并拍照，细胞培养过程每48 h半换液，每96 h全换液。并于第0、2、5、7、12、14、20天取样，检测细胞亚群和细胞凋亡状态。详细检测流程可参考链接。

三、注意事项

• 采集样本一定要严格遵循无菌操作规范，于超净台内完成所有步骤。
• 样本采集后尽可能在4 h内完成分选实验，分选后若来不及激活，可使用激活培养基重悬细胞，短暂保存于4℃冰箱暂存，保存时间不超过3 h。
• 细胞激活3-5天内需根据细胞状态及时去除激活微球，避免持续刺激诱导过早耗竭。可设置细胞和磁珠的梯度比例及梯度激活时间，选择最佳的激活条件。
• 每次全换液传代前需镜检确认细胞活率＞90%，并记录细胞形态、聚团程度及悬浮/贴壁比例；若活率低于阈值，需立即终止实验并溯源污染或操作偏差。传代时采用轻柔吹打法收集细胞，严禁剧烈震荡或反复吸吹，以减少机械损伤与非特异性凋亡。
• 传代收集细胞，离心力最大不超过300×g，若死细胞较多，可降低离心力至100-150×g以去除死细胞；离心机升速不超过3，降速不超过2，降低离心导致的细胞损失。
• 细胞检测过程注意添加Human Fc Receptor Blocking Solution进行封闭，并通过Fixable Viability Kit染色去除死细胞，获取更准确的数据。

四、相关产品列表

小结

本次实验详细对比了三种来源T细胞起始群体（PBMCs、CD3⁺T细胞、Pan Naive T细胞）在IL-2单因子长期培养体系下的扩增效能、亚群命运轨迹与功能稳态维持能力，三者存在显著差异，若您对于详细细节想要了解更多，欢迎在评论区留言交流。后续我们将持续分享T细胞长期培养代谢检测和状态分析策略，敬请期待！

参考文献

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