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102 人阅读发布时间:2026-06-10 16:09
克隆号的本质,是分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的编号,相当于单克隆抗体的专属“身份证”。靶点决定抗体“识别哪一个蛋白”,而克隆号决定抗体“识别该蛋白的哪个位置、以何种亲和力结合、对样本处理的耐受程度”。大量实验室数据与国际流式细胞学会(ISAC)的标准化指南已经证实:同一靶点的不同克隆号,在相同体系下的检测性能可存在数量级差异。
在实际操作中,研究者经常会跨越多种实验场景,每个场景对克隆号的要求各异,一招走天下的选择思路,往往让后续的流式数据一团糟。
本文将从六大核心应用场景出发,逐一解析克隆号选择的关键要点,帮助实验者在每个环节都能选对克隆号,让流式实验不再“翻车”。
活细胞表面抗原检测是流式基础免疫分型最常见的一类应用,其核心原则是:抗体必须在细胞膜保持完整、蛋白保持天然构象的条件下与靶标结合。因此,所选克隆号必须能够识别目标抗原上的胞外区构象表位,也就是由蛋白质三维折叠形成的、位于细胞外区域的空间结构。
例如T细胞的分析检测中,CD3抗体的不同克隆号存在较大差异,如OKT-3识别T细胞受体复合物的ε链,UCHT1主要靶向CD3向的胞外域,CD3-12主要靶向CD3向的胞内段,在活细胞表面染色中的表现存在差异,因此,在活细胞表面抗原检测中,选择经流式验证、明确标注适用于活细胞表面染色的克隆号是做对实验的第一步。(详细克隆号选择见文末汇总分析表)
在干细胞研究、稀有细胞亚群分析以及某些免疫细胞功能标志物检测中,研究者常常面临着“目标抗原表达量极低”的挑战。这种场景下,亲和力成为克隆号选择的核心考量指标。高亲和力克隆号即使在细胞表面抗原低表达的条件下也能稳定结合并产生强信号;而低亲和力克隆号可能因结合不牢固,在洗涤步骤中被洗脱,导致信号较弱甚至假阴性结果。
例如在肿瘤微环境中,CD8抗原的表达通常较低,若选用的克隆号亲和力不足,将难以精准识别这些低丰度抗原,需要选择高灵敏的OKT-8来更好地检测到相关低比例的CD8+T细胞。
值得注意的是,高亲和力不等于高特异性,部分高亲和力克隆号反而容易发生交叉反应,可能与非目标抗原结合,降低检测信噪比。因此,在低丰度标志物检测中,既要关注亲和力指标(如染色指数SI),也要结合文献验证该克隆的特异性表现,二者缺一不可。
检测胞内或核内抗原(如细胞因子、转录因子Foxp3、T-bet等)时,样本必须经过固定和破膜处理,使抗体得以进入细胞膜甚至细胞核内部。该处理过程会改变抗原蛋白的天然构象,甚至破坏线性表位的完整性,因此并非所有适用于表面染色的克隆号都能胜任胞内检测任务。
在胞内抗原检测中,克隆号的选择必须优先考虑经过固定破膜染色验证的抗体。Foxp3作为核心转录因子需经过固定破核膜处理后才能被抗体识别,一旦破膜效果不佳或所选克隆号在固定条件下完全失去结合活性,染色信号将显著劣化,甚至导致目标蛋白完全无法被检测。因此,挑选专门针对核内蛋白优化、经胞内染色验证的克隆号至关重要。
例如,核内Foxp3检测推荐的克隆号中,小鼠Foxp3推荐FJK-16s(经Nature、Immunity等顶刊广泛引用),人Foxp3推荐PCH101,T-bet推荐4B10,均经过固定破膜体系验证;同样的搭配核内指标的表染抗体也要选择耐固定的克隆号(详细克隆号选择见文末汇总分析表)。
此外,固定破膜试剂的选择本身也可能影响克隆号的兼容性。部分识别构象表位的克隆号在经甲醛固定后可能完全失去结合能力。这意味着在选择克隆号的同时,也需要选择与克隆号兼容的固定破膜方案。
在多色方案中,多个抗体需在同一个样本中同时孵育,不同克隆号之间可能发生空间位阻或表位竞争,导致部分信号减弱甚至丢失。因此,在多色免疫分型实验中,克隆号之间的相互兼容性成为影响实验结果的关键变量。
例如在T细胞精细免疫分型中,每一个抗体克隆号的筛选都需要经过系统性的交叉兼容性验证,以确保在外周血单个核细胞(PBMCs)与全血样本中均能保持稳定染色。在设计多色Panel时,需要系统评估各克隆号的兼容性,一方面检查是否有两个克隆号识别同一抗原的相邻表位从而导致免疫学竞争,另一方面通过共孵育实验排查非预期的空间位阻效应。例如有研究发现,CD8α抗体(如克隆11/295/33)与CD8β(如PPT23或PG164A)共孵育时,可导致后者结合效率显著下降甚至信号丧失。
此外,在多色Panel设计中还需要充分重视荧光素偶联的影响。同一克隆号在与不同荧光素偶联后的信号强度和背景水平可能存在差异,优先选择在多色方案中有广泛引用数据的克隆-荧光素配对,并结合单染对照与FMO对照来最终确认分辨率是否满足实验需求。
在涉及细胞刺激、阻断或功能性分析的实验设计中,克隆号的选择不仅关乎“检测效果”,更直接关联“功能效应”。不同克隆号的抗体可能通过对靶分子的结合位点差异,产生截然不同的功能活性。有的可能激活下游信号通路,有的则可能拮抗配体结合,还有的可能对受体功能无任何影响。
例如在T细胞活化检测中,CD3抗体的不同克隆号对应的激活方式存在显著差异,HIT3a克隆抗体适合以可溶性形式刺激T细胞,而UCHT1克隆则需要预先包被才能发挥激活效应,两者不可互换使用;在Natural Killer(NK)细胞的扩增实验中,抗CD16抗体的CB16克隆能高效促进NK细胞活化和扩增,而MEM-154克隆基本没有活性;在PD-1/PD-L1的相关研究中,克隆号RMP1-14能够阻断PD-1/PD-L1通路并激活免疫细胞,而克隆号RMP1-30则完全不具有这种阻断功能。
只要实验目的涉及抗体产生活性效应,无论激活、阻断还是内化诱导,就不应单纯依赖常规流式检测用的克隆号,而必须事先确认所选克隆的详细功能信息。查阅靶点功能抗体的文献报道永远是最靠谱的方式。
某些特殊处理条件会改变抗原表达特性,此时克隆号的选择往往成为实验成功的关键突破口。
例如Th1/Th2/Th17功能研究中常见的PMA(佛波酯)刺激操作,PMA可诱导人T细胞表面CD4部分内吞并在溶酶体中加速降解,导致采用常规CD4抗体进行检测时阳性信号显著下降,阴阳性细胞群无法区分,需要选择受内吞影响较小的克隆号SK3,在刺激后仍能清晰区分CD4阳性与阴性细胞群。
总之,当样本处理触及靶分子表达特性发生变化时,常规克隆号的适用性可能“失效”,需要寻找绕过内吞表位的替代克隆。
综合以上,流式实验选择抗体时应坚持应用验证优先,从权威来源获取建议,并借助文献数据库回溯验证,警惕克隆号相关的各类实验坑点,将克隆号作为实验设计的首要考量,以保障流式数据质量与科研成果的可验证性和可重复性。
小E总结了人和小鼠常见的T细胞免疫分型检测抗体克隆号选择为大家参考,如下表所示。
表1. 人T细胞免疫分型检测抗体克隆号选择
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指标 |
克隆号 |
特点 |
应用场景 |
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CD3 |
OKT3 |
CD3ε胞外域表位,与UCHT1/SK7表位重叠、相互竞争;激活能能力极强,交联后触发T细胞增殖、IL-2/IFN-γ大量分泌;适用于活细胞检测,固定后易失活。 |
T细胞功能实验金标准,T细胞体外激活/增殖实验、CAR-T制备、功能性刺激、移植免疫研究。 |
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UCHT1 |
CD3ε胞外域表位,构象依赖,可染表面+胞内CD3;激活能力弱,不引发强增殖/细胞因子风暴;适用于活细胞、固定/破膜(温和)、冰冻切片。 |
流式常规+胞内染色、免疫表型分析、胞内染色、多色panel。 |
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SK7 |
CD3ε胞外域表位,构象稳定、固定耐受好;激活能力中等,可溶性抗体需单核细胞辅助才显丝裂原活性;适用于活细胞和固定细胞、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)、冰冻切片。 |
临床型,标准化检测+石蜡IHC、免疫组化(FFPE/冰冻)、T细胞分选、多色补偿稳定。 |
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HIT3a |
CD3ε胞外域表位,仅识别天然构象的表面CD3,不结合胞内CD3;激活能力弱,适合无激活的表型分析;适用于活细胞,破膜后失效。 |
表面专属,避免胞内干扰、避免胞内信号干扰、高纯度T细胞分选。 |
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MEM-57 |
CD3δ-ε/γ-ε复合物构象表位,不识别游离CD3ε;激活能力中等,依赖TCR交联;适用于活细胞、温和固定。 |
TCR/CD3复合物完整性检测、免疫沉淀、构象研究。 |
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CD3-12 |
CD3ε胞内段线性表位,高度保守、跨物种反应广;无激活能力;适用于强固定/破膜、石蜡切片、Western Blot。 |
胞内CD3染色专属、胸腺细胞发育分析、跨物种免疫组化、WB。 |
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CD4 |
SK3/ Leu3a |
CD4胞外域D1区域,构象依赖,与OKT4表位部分重叠,可部分阻断SK3克隆抗体的结合;激活能力弱,不引发CD4+T细胞强增殖及细胞因子分泌;耐甲醛固定,适配活细胞、温和固定/破膜样本、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本、冰冻切片。 |
临床与科研通用;对内吞不敏感(PMA刺激下仍可检出);Th1/2/17等细胞因子检测;HIV感染研究;免疫表型分析。 |
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OKT-4 |
CD4胞外域D1区域,构象依赖,与RPA-T4表位部分重叠,可竞争性结合CD4分子;激活能力极强,交联后可高效触发CD4+T细胞增殖、IL-2、IFN-γ等细胞因子大量分泌;固定后易失活,优先适配活细胞,温和固定后信号显著减弱,强固定(如福尔马林)后完全失活,不适合固定/破膜样本及石蜡切片检测。 |
经典激活型,功能实验专用;常规免疫分型;T细胞功能研究;HIV研究;CD4⁺T细胞增殖、分化及信号传导研究。 |
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RPA-T4 |
CD4胞外域D1区域,构象依赖,与OKT4表位部分重叠,可部分阻断SK3克隆抗体的结合;激活能力中等,单独使用时激活作用温和,交联后可轻度诱导CD4⁺T细胞增殖,具备功能阻断特性,可阻断HIV与CD4的结合;对甲醛固定耐受性差,适配活细胞、温和固定样本、免疫细胞化学/免疫荧光样本,可用于流式细胞术、免疫沉淀、Western Blot等多平台。 |
多场景兼容,功能阻断型:多平台适配性强,适合HIV感染机制研究、CD4+T细胞功能调控及多平台联合检测实验,种属交叉反应性有限,主要适用于人及黑猩猩样本。 |
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13B8.2 |
CD4胞内段线性表位,高度保守,可识别游离的CD4胞内片段及胞内表达的CD4分子,跨物种反应性广(可识别人、猴、犬等物种的CD4);无激活作用,因识别胞内表位,不与细胞表面CD4结合;耐固定,适合胞内CD4检测场景,适配强固定/破膜样本,活细胞检测无信号。 |
胞内/跨物种专用:跨物种兼容性好,胞内表位识别稳定,适合胸腺细胞发育分析(追踪早期CD4⁺T细胞)、胞内CD4表达检测、跨物种免疫研究及Western Blot实验,可避免表面CD4信号的干扰。 |
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CD8 |
SK1 |
识别CD8α胞外构象表位,最大优势是不与MHC四聚体竞争结合,信号强度稳定,对1-4%PFA温和固定的耐受性好,可兼容活细胞与固定样本染色,弱激活特性不会干扰细胞功能实验,多色流式中补偿稳定性佳、非特异性染色低。 |
最通用克隆,常规T细胞分型(CD3/CD4/CD8联合染色)的,适用于全血、PBMC等样本的标准化检测;可用于固定样本后续的胞内染色实验;同时适配多色流式Panel构建,广泛应用于基础科研与临床常规检测。 |
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OKT-8 |
识别CD8α胞外表位,活细胞染色信号极强,灵敏度高,部分抗原对应的MHC四聚体染色中可协同增强信号;但固定耐受性差,经固定处理后信号会明显减弱,甚至出现分群模糊的情况。 |
适合高灵敏度检测需求,如低表达CD8分子的细胞亚群、稀有CD8+T细胞的检测; CAR-T与临床治疗质控中应用广泛,是可靠的标志物。 |
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Hit8a |
识别CD8α胞外独特表位,完全不与MHC四聚体竞争结合,是抗原特异性CD8+T细胞检测的专属优选克隆;活细胞染色效果好,对温和固定有中等耐受性,但胞内染色效果一般,信号强度中等。 |
四聚体友好型克隆号,MHC四聚体与CD8共染实验的金标准,广泛应用于肿瘤、感染性疾病中抗原特异性CD8+T细胞的检测;适合多色MHC四聚体Panel构建,可同时检测多种抗原特异性CD8+T细胞亚群;基础科研中抗原特异性T细胞功能相关实验。 |
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UCHT-4 |
识别CD8α胞外构象表位,该抗体免疫原为人胸腺细胞及外周血T细胞,可识别CD8αα同源二聚体和CD8αβ异源二聚体,在胸腺细胞和成熟T细胞中均有良好反应性;活细胞染色信号稳定,非特异性染色低;对常规福尔马林固定样本的表位敏感,固定耐受性较弱,温和固定条件下可保留部分信号,多色流式补偿稳定性良好,信号强度略弱于SK1、OKT-8。 |
适用于基础科研及部分临床的常规CD8+T细胞分型(全血、PBMC样本),可与CD3、CD4抗体联合使用完成T细胞亚群分析;适配流式细胞术、免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)等多种实验方法,尤其适合需要同时进行流式与免疫荧光检测的实验,可实现一抗多用,减少实验误差。 |
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HI149 |
识别CD8α胞外特定表位,活细胞染色特异性强,非特异性染色极低,与MHC四聚体无竞争结合,多色流式Panel兼容度高,信号强度中等;对温和固定(1-4% PFA)有一定耐受性,可用于短期固定样本的染色,固定后信号保留较完整,批次稳定性良好,仅与人CD8分子反应,无种属交叉反应。 |
主要用于基础科研中常规CD8+T细胞分型、CD8+T细胞亚群筛选,适配全血、PBMC及分选后细胞的流式检测;适合多色流式Panel构建,尤其适合与其他高信号抗体搭配使用,减少补偿干扰;可用于CD8+T细胞阳选分选,分选后细胞活性保留较好。 |
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B9.11 |
识别CD8α胞外稳定构象表位;对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的耐受性较好,活细胞染色效果佳,温和固定后信号保留完整,多色流式Panel兼容度高,信号强度略弱于SK1和OKT-8,但批次稳定性强,适合临床标准化检测。 |
主要用于临床流式常规CD8分型,适配全血、PBMC等临床样本的批量检测;可兼顾免疫组化实验(冰冻切片、石蜡切片),实现流式与IHC实验的抗体统一,减少实验误差;基础科研中也可用于常规分型,适合对批次稳定性要求高的实验。 |
表2. 小鼠TBNK免疫分型检测抗体克隆号选择
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指标 |
克隆号 |
特点 |
应用场景 |
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CD3 |
145-2C11 |
识别小鼠CD3ε链胞外表位,该克隆识别的表位依赖CD3ε链与δ或γ链的构象结合,无法识别仅表达单独ε链的细胞,对部分NK肿瘤可能无法检测。信号强度极强、特异性极高,无种属交叉反应(不与大鼠白细胞反应);对1-4% PFA温和固定耐受性好,可兼容活细胞与固定样本染色,多色流式中补偿稳定性佳;可通过结合CD3ε链启动T细胞活化信号,兼具流式检测与功能实验适配性;C57BL/6、BALB/c 等常用小鼠均适用。 |
金标准克隆,小鼠CD3流式检测,适用于常规T细胞分型(CD3/CD4/CD8联合染色),适配小鼠全血、脾脏、胸腺、淋巴结、PBMC及肿瘤浸润T细胞等各类样本;可用于固定样本后续的胞内染色实验(如T细胞内细胞因子、转录因子检测);同时适配T细胞分选、活化、耗竭及阻断实验,广泛应用于基础科研(肿瘤免疫、自身免疫病、感染模型)及部分临床前小鼠实验,也可兼顾免疫组化(冰冻切片)、免疫沉淀(IP)等多方法学验证。 |
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17A2 |
识别小鼠CD3分子胞外保守构象表位,非特异性染色低,多色流式Panel兼容度高。对温和固定有一定耐受性,但强固定(4% PFA长时间固定)后信号会略有衰减,活细胞染色信号稳定;可通过结合CD3分子启动T细胞活化与增殖;C57BL/6、BALB/c等常用小鼠均适用。 |
常规小鼠T细胞表型分析,适配小鼠脾细胞、胸腺细胞、外周血及淋巴组织样本的流式检测,是基础科研中常规T细胞分型的常用备选克隆;可用于T细胞亚群鉴定、免疫应答研究及肿瘤免疫微环境分析,适配多色流式Panel构建,尤其适合与CD4、CD8、PD-1等抗体联合检测,也可用于免疫荧光(IF)实验。不适合低表达CD3的稀有T细胞亚群检测。 |
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CD4 |
GK1.5 |
CD4胞外区表位,与RM4-5竞争同一表位,与RM4-4不竞争,亮度高、特异性好、背景低;1-2% PFA-温和固定可保留信号,适合-表面+胞内共染(Treg/Th17),强固定/破膜后信号下降明显;C57BL/6、BALB/c等常用小鼠均适用。 |
最常用的流式检测克隆号:常规CD4+T细胞分型、Treg(CD25/Foxp3)、Th1/Th2/Th17多色Panel、脾脏、淋巴结、全血、肿瘤浸润淋巴细胞、分选后细胞仍可用于功能实验(增殖/细胞因子)。 |
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RM4-5 |
CD4 胞外区表位,与GK1.5竞争,与RM4-4无竞争,比GK1.5更具亲和力,信噪比更高;对温和固定耐受良好,胞内染色信号保留优于GK1.5。 |
体内实验流式检测抗体:高亮度、适合多色与稀有亚群(低表达CD4、TIL等)。 |
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RM4-4 |
CD4另一胞外区表位,与GK1.5,RM4-5无竞争;亲和力中等偏强,背景干净;耐温和固定(1%-4% PFA),可用于表面染色后固定、轻度破膜,适配Treg/胞内细胞因子联合染色,固定剂耐受程度RM4-4 强于GK1.5,略弱于RM4-5。 |
可通过搭配荧光素实现同时检测,是T细胞分选的理想选择;也用于同管双克隆染色(如GK1.5+RM4-4),验证CD4表达真实性、排除表位丢失;胸腺细胞发育(CD4/CD8 双阳性阶段)。 |
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YTS191 |
CD4胞外近膜区表位,可阻断CD4–MHC II结合,与GK1.5竞争;固定后信号丢失严重,仅限活细胞染色。 |
经典耗竭剂,更适合功能实验(体外T细胞活化抑制、共刺激阻断实验)而非单纯表型;常用于体内CD4阻断/清除模型(自身免疫、移植耐受);CD4 分子构象与功能关系研究;不适合高灵敏度表型分析。 |
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CD8 |
53-6.7 |
小鼠CD8α胞外表位,识别CD8αα/CD8αβ,不与MHC-I四聚体产生明显竞争,适合抗原特异性CD8+T检测;无明显T细胞活化,表型染色安全;固定耐受性良好,耐受1%-4% PFA温和固定,可常规破膜、胞内因子/转录因子共染。 |
科研金标准、全能:脾脏/淋巴结/胸腺/TIL/外周血全样本通用;TIL、肿瘤浸润CD8+T、耗竭T细胞检测、胞内染色(IFN-γ、Granzyme B、Perforin)、多色Panel、细胞分选、长期固定上机。 |
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YTS169.4/ YTS-169 |
CD8α近膜区功能表位,可阻断CD8–MHC I结合;固定耐受性差,仅适合新鲜活细胞,固定、破膜后信号大幅下降,不能用于胞内染色。 |
低内毒素,专为体内实验设计,特异性强,适合体外阻断、体内CD8+T清除/耗竭模型、体外CD8功能阻断实验。 |
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NLDC-145 |
CD8β链特异性表位,只识别CD8αβ异二聚体,不识别肠道、胸腺部分CD8αα双阳性亚群、NK样CD8细胞;固定耐受性中等,温和PFA可用,不适合强通透。 |
精准区分常规外周成熟CD8αβ+细胞毒性T检测,会漏检CD8αα细胞,不能作为通用CD8总标记;可排除CD8αα非常规亚群,做亚群精细分群,黏膜免疫、胸腺发育细分研究。 |
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