Elabscience 光谱流式全流程详解：从入门到实操，一文讲透

一套完整的光谱流式实验，可以拆解为五个关键步骤：实验设计、样本制备、仪器设置与上机采集、光谱解析、数据后续分析。

• 确定仪器配置：先了解所用光谱流式仪器的激光器数量和波长配置（常见的有355 nm、405 nm、488 nm、561 nm、640 nm等），以及荧光通道数量。5激光配置的仪器通常拥有64个荧光通道，3激光配置则有38个左右。不同的激光器决定可以使用哪些荧光染料。

• 明确检测目标：根据您的研究目的，确定需要检测的生物标志物，并按表达丰度将其分为高表达、中等表达和低表达标记。亮度高的荧光素应优先分配给低表达标记。

• 荧光素选择与优化：光谱流式的一个突出优势是能够使用光谱特征相似甚至高度重叠的荧光素，但仍建议尽量选择光谱分布多样化的组合，以提高解混准确性。可以利用在线工具（如）查询各荧光素之间的相似性指数（Similarity Index，SI）即光谱重叠系数，SI越接近0越好区分，越接近1则越难拆分，通常要求SI低于0.98，方可进行良好的解混区分。（注：具体的重叠系数需根据具体厂家的光谱流式细胞仪来分析，可能会由于解混算法的差异导致不同荧光基团的重叠系数存在差异。）

• 必备对照：光谱解混离不开准确的参考光谱。每个荧光素都必须制备单染对照管，可以用补偿微球或阳性细胞来建立参考光谱。同时，必须设置未染色的空白样本管，用于建立自发荧光参考模型。另外，死活染料和FMO对照（荧光减一对照）同样不可或缺，死细胞的非特异性染色会严重干扰解析结果。

• 组织样本处理：如需检测组织样本，需通过机械法（剪碎、研磨）或酶消化法（如胶原酶、胰蛋白酶）将组织充分解离为单细胞悬液。优化消化和酶处理步骤是提升样本质量的关键。

• 血液样本处理：对于外周血样本，通常需要裂解红细胞或用密度梯度离心法（如Ficoll）分离PBMC。推荐将冻存PBMC在37℃水浴中快速复苏（约90秒，期间每隔15-20秒轻柔颠倒混匀），然后立即用预热的培养基稀释，300 × g离心3-5分钟弃上清，再用PBS重悬计数。建议确保细胞存活率高于90%，否则应考虑另取样本。

• 抗体染色：按照预滴定优化的浓度配制抗体预混液。染色过程中及上机等待期间，样本应始终保持避光保存，并尽快上机采集，以避免荧光信号衰减和样本劣化。建议在上机前用滤网过滤样本，彻底杜绝细胞团块堵塞仪器的风险。

• 开机与质控：严格按照仪器操作规程启动设备，运行日常性能质控，检查激光功率、液流稳定性和检测器灵敏度等关键指标，确保仪器状态最优。

• 建立实验方案：在配套软件中创建新实验，选择所用荧光染料，添加样本管信息（通常包含多色样本和参考对照样本），设置采集停止条件（如采集细胞数或体积）。

• 电压调节：使用阴性对照样本调节各检测通道的电压，使阴性群体的信号落在合适区间，既不过饱和也不淹没在背景噪声中。

• 阈值设定：根据检测对象设置合适的阈值参数。如果目标是纳米级颗粒（如细胞外囊泡或病毒），需启动小颗粒检测模式并用VSSC信号来触发采集，避免微小颗粒被误判为背景噪音而漏掉。

• 光谱解析的核心原理：假设各个荧光素的参考光谱已知，通过求解超定方程组，利用最小二乘法将混合信号反推出每个荧光素的贡献信号。只要检测器数量超过荧光染料数量，这一过程在数学上就有唯yi解。

• 创建光谱库是第一要务：完成参考对照样本的样本采集后，在软件中将所有单染对照管的参考光谱导入系统，这些光谱将被存入光谱库，成为每次实验中信号拆分的“模板”。

• 全自动的解析过程：软件会自动识别每个检测器采集到的混合信号，然后调用光谱库中的参考光谱，通过算法计算出每种荧光素在总信号中的贡献分量，最终输出各荧光参数对应的信号强度，将参考样本解析后的参考光谱应用到多色样本，即可自动完成荧光补偿调节。

• 特别注意的关键要点：单染对照所使用的细胞基质（如PBMC、补偿微球、细胞系）最好与实际检测样本一致。因为不同基质背景的自发荧光特征不同，直接使用微球建立的光谱库应用到组织样本上可能会引入解混误差。

光谱解析后的数据与其他流式细胞术数据格式类似（通常是FCS文件格式）。推荐使用FlowJo、FCS Express等专业软件进行后续的门圈分析和可视化。

• 设门策略：建议先通过FSC/SSC初筛排除细胞碎片和黏连体，再利用死活染料排除死细胞，随后逐级圈定目标细胞群体。

• 高维数据探索：当涉及20色以上的高维数据时，传统的双轴散点图设门往往力不从心。此时可以考虑引入UMAP或T-SNE等降维分析算法，将高维数据压缩映射到二维空间进行可视化和聚类分析。

• 数据呈现：最后统计各组群细胞比例或荧光强度中位数（MFI），选择合适的图表（如散点图、直方图、热图）呈现最终结果。

图1. 人外周血T细胞16色全光谱分析和T-SNE降维分析结果

表2. 相关流式抗体汇总

下表整理了光谱流式实验中实操中最易被忽视的几个关键陷阱和相应注意事项。

以上从原理差异、全流程实操到避坑要点，全面梳理了光谱流式的核心内容。希望这份指南，能帮大家顺利开展光谱流式实验，高效解决科研问题。Elabscience^®也为您提供全光谱验证流式抗体，为您的科研保驾护航~