带EGFP的细胞如何做凋亡？Elabscience Annexin V配色避坑攻略，一文吃透！

在生物研究中，我们有时会遇到对带有荧光的细胞进行凋亡检测的情况，如EGFP。EGFP（增强型绿色荧光蛋白）是最常用的细胞标记蛋白之一，可以在蓝光（488 nm激光）照射下发出绿色荧光。通常以转染的方式将GFP基因融入目标细胞中，以标记特定的细胞类型、观察蛋白的表达情况或基因的表达活性等。

Annexin V是常用的细胞凋亡检测方法之一，通过其在特定环境下与磷脂酰丝氨酸（PS）的结合能力，可对因凋亡而导致PS外翻至细胞膜外表面的细胞进行鉴定；结合核酸染料（如PI）的使用，可进一步分辨凋亡早期与晚期（含继发性坏死）的细胞。

对于带有EGFP的细胞，如何使用Annexin V的方法对其进行检测呢？Annexin V通常通过流式细胞仪对其上标记的荧光素进行检测，目前最常见的是FITC（绿色荧光）。但FITC与EGFP的激发和发射光谱高度重叠，在传统的荧光流式细胞仪中使用同一个通道进行检测会出现光谱重叠（如图1），因此当使用了EGFP对细胞进行标记后，无法再使用FITC标记Annexin V进行检测。

图1. FITC与EGFP光谱重叠情况

通过上述情况可以得知，若要对含有EGFP的细胞进行凋亡检测，首先需要避开Annexin V标记荧光的光谱冲突。此时，使用APC标记Annexin V蛋白是理想选择之一。APC与EGFP的激发光谱和发射光谱都有明显差异，检测通道也相距较远，几乎不会产生相互干扰（如图2）。但需注意的是，APC需要使用638 nm或640 nm的红色激光激发，使用前需确认流式细胞仪有对应的激光器。

图2. EGFP（左图）与APC（右图）激发光谱与发射光谱展示

当流式细胞仪没有适用APC的激发光时，可使用PE作为Annexin V的标记荧光，但EGFP的发射光谱对PE的检测通道有一定的溢漏（如图3），需要对比原始细胞（不带有EGFP的同种细胞）和未进行Annexin V染色的细胞（仅含有EGFP荧光）的结果进行补偿调节，以得到更准确的结果。

图3. EGFP与PE荧光发射光谱重叠情况展示

此外，当使用核酸染料分析早期和晚期凋亡时，由于EGFP与PI的发射光谱也有较多重叠，因此建议更换其他类型的核酸染料。理想条件是使用DAPI作为核酸染料，可确保与EGFP之间没有干扰存在，但DAPI需要使用紫色激光（405 nm）激发，需确保仪器的适用性；如果没有对应的激光器，可适用7-AAD作为核酸染料，该染料与EGFP发射光谱的重叠程度比PI小（如图4），但仍需要设置EGFP单染样本进行补偿调节。

图4. EGFP与PI及7-AAD荧光发射光谱重叠情况展示

对带有EGFP的细胞进行Annexin V凋亡检测，可以通过流式细胞仪的仪器配置选择不同的实验方案。

• 如果使用的仪器有488 nm、405 nm和640 nm激光器，可使用Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Kit（E-CK-A258）染色，不需要进行补偿调节；

• 如果仪器有488 nm和640 nm激光器，可以使用Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Kit（E-CK-A218）染色，此时需要设置EGFP单染调节其对7-AAD检测通道的补偿；

• 如果仪器只有488 nm激光器，可以使用Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit （E-CK-A216）染色，此时必须设置EGFP单染调节其对PE和7-AAD检测通道的补偿。

以上就是带EGFP的细胞利用Annexin V进行凋亡检测的关键要点，合理选择荧光组合与核酸染料，结合仪器配置优化实验方案，就能得到干净可靠的数据~