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Erastin作为经典的铁死亡诱导剂，通过抑制细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸逆向转运体System Xc-（xCT），阻断胱氨酸摄取，导致谷胱甘肽（GSH）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活，最终引发脂质过氧化累积和细胞死亡。HepG2细胞（人肝细胞癌细胞）对Erastin高度敏感，是体外模拟Erastin诱导铁死亡研究的理想模型。

所需试剂与材料

本次实验用到的核心试剂及对应作用整理如下，按需准备即可：

试剂名称	作用
10 mmol/L Erastin	铁死亡诱导剂（System Xc⁻抑制剂）
Lip-1	铁死亡抑制剂
脂质过氧化物(LPO)荧光法测试盒	检测脂质过氧化水平
谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)比色法测试盒	检测GPX4酶活性
胱氨酸摄取荧光法测试盒	检测胱氨酸摄取能力
增强型细胞活力检测试剂盒(CCK-8)	检测细胞活力变化

Erastin诱导HepG2细胞铁死亡模型建立

1、细胞培养

取处于对数生长期的HepG2细胞，调整密度至2×10⁵个/mL，按不同实验需求接种至相应培养板中。使用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM完全培养基，于37℃、5% CO₂培养箱中常规培养24 h，待细胞贴壁后进行处理。

培养板类型	每孔接种体积	每孔细胞数	用途
96孔板	0.1 mL	≈2×10⁴个	CCK-8，胱氨酸摄取
24孔板	0.5 mL	≈1×10⁵个	LPO
6孔板	2 mL	≈4×10⁵个	GPX-4

注：不同检测指标对细胞量需求不同，请根据上表选择合适的培养板及接种量，以保证检测灵敏度与线性范围。

2、Erastin处理方案及不同指标的检测

（1） CCK-8 & LPO检测

HepG2细胞贴壁后，加入终浓度为10 μmol/L的Erastin，处理24 h。实验需设置以下对照：

阴性对照：等体积DMSO处理
Rescue对照：10 μmol/L Erastin + 2 μmol/L Lip-1
阳性对照：2 μmol/L Lip-1处理24 h

处理结束后，分别采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，以及LPO荧光法测试盒检测脂质过氧化水平。

图1. CCK-8细胞活力检测结果

图2. 脂质过氧化水平检测结果

结果显示，与阴性对照组相比，Erastin单独处理可显著降低HepG2细胞活力，同时伴随LPO水平的明显升高；而当Erastin与Lip-1共处理时，细胞活力得到部分甚至完全恢复，LPO水平亦相应回落，表明Lip-1能够有效逆转Erastin所诱导的铁死亡特征性改变。

（2） GPX4、胱氨酸摄取检测

取接种于6孔板的细胞，以10 μmol/L Erastin处理24 h，对照组加入等体积DMSO。收集细胞后，分别使用GPX4比色法测试盒和胱氨酸摄取荧光法测试盒进行检测。

图3. GPX4检测结果

图4. 胱氨酸检测结果

实验结果显示，与对照组相比，Erastin处理组细胞的胱氨酸摄取能力显著降低，同时GPX4酶活性亦呈现明显下降趋势，二者均与铁死亡发生的分子机制相吻合。System Xc⁻被抑制后胱氨酸供应减少，GSH合成受阻，进而导致GPX4活性丧失，脂质过氧化清除能力下降。

3、注意事项

① 细胞易聚集在孔板中央，分布不均匀，影响细胞生长和药物作用，接种后应前后左右轻摇混匀。

② Erastin需-20℃避光保存，工作液现配现用，用PBS稀释可能析出，建议使用DMSO稀释，在实验分组中可加入DMSO的对照组，板孔中的DMSO含量不超过1%。

③ LPO荧光探针需避光操作，防止淬灭。

④ 不同的铁死亡指标在样本中的含量不同，检测时需跟进指标的含量，接种到不同的细胞培养板获取不同的细胞量用于实验。

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Erastin诱导HepG2模型是铁死亡研究的经典体系，但实验成败往往藏在细胞接种量、对照设计和探针避光等等细节里。理清流程、配齐工具、盯住关键指标，才能让数据经得起推敲。

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