Elabscience|肺泡巨噬细胞研究必看：LPS诱导急性肺炎模型制备与检测全攻略

在呼吸免疫研究中，巨噬细胞与急性肺炎的关系备受关注。但不少研究者在实操中常遇到困惑：急性肺炎模型怎么建？肺泡巨噬细胞怎么分离？流式检测怎么圈门分析？

本文主要介绍如何通过肺泡灌洗液（BALF）分离巨噬细胞，并用流式细胞术检测正常与急性肺炎状态下的变化差异，以期为广大科研人员的呼吸免疫研究提供实验参考。

一、巨噬细胞与呼吸系统疾病研究现状

肺炎及由此引发的急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是临床常见的急危重症，以肺泡-毛细血管屏障破坏、肺水肿及失控性炎症反应为主要病理特征，死亡率高达30%–45%^[1]。尽管机械通气等支持手段不断进步，但针对其核心病理环节的特异性治疗手段仍然匮乏^[2]。

巨噬细胞是肺部固有免疫的核心细胞，在炎症调控、组织修复与纤维化进程中扮演关键角色^[3]。肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophages, AMs）约占肺泡免疫细胞的70%，定居于肺泡腔表面，被称为免疫细胞中的"清道夫"，能够直接吞噬吸入肺部的病原体和有害颗粒物^[4]。在稳态下，AMs主要表现为M2抗炎表型，维持组织免疫耐受；当遭遇脂多糖（LPS）等病原相关分子模式刺激后，AMs迅速向M1促炎表型极化，释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，驱动中性粒细胞募集和肺损伤^[5]。研究表明，M1/M2极化的失衡是ALI发生发展的关键机制。

图1. 肺的结构和细胞组成

A. 近端气道由纤毛细胞、分泌黏液的杯状细胞、分泌性柱状细胞、绒毛细胞、未分化基底细胞以及神经内分泌细胞构成。B. 肺泡类型1（AT1）和类型2（AT2）上皮细胞构成了远端气道。驻留肺泡巨噬细胞持续监测周围微环境，以识别潜在的有害病原体^[3]。

经鼻滴注LPS诱导急性肺炎模型是研究ALI的经典方法。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，经气道给药后能够有效激活肺泡巨噬细胞，诱发以中性粒细胞浸润和炎症因子风暴为特征的急性肺部炎症反应，较好地模拟了人类细菌性肺炎和ALI的病理过程^[6]。

接下来，小E将带大家完整演示从模型制备到流式检测的实验全流程。

二、正常vs急性肺炎小鼠肺泡灌洗液巨噬细胞分离检测全流程

肺泡灌洗液巨噬细胞是指通过支气管肺泡灌洗技术从肺内腔隙获取的巨噬细胞群体，主要为肺泡巨噬细胞（AMs），是肺部抵御病原体入侵的首道免疫屏障。在肺炎小鼠模型中，检测BALF巨噬细胞的数量、吞噬活性、细胞因子分泌及表面标志物变化，可实时反映肺组织局部炎症状态与免疫应答动态，定量评估炎症损伤程度及修复趋势。并可早期评价抗炎药物或干预措施对肺部微环境的重塑效果，为肺炎的临床治疗策略提供实验基础与理论指导。

1. 急性肺炎小鼠模型制备

（1）称取适量LPS，用无菌PBS溶解配制成1 mg/mL的储存液，-20℃保存。

（2）选用C57BL/6J小鼠，将小鼠置于直立位，LPS按照20 mg/kg的剂量进行滴鼻。

（3）用移液器吸取LPS溶液，每次将液滴缓慢置于一侧鼻孔，等待小鼠自然吸入。

（4）滴注后保持小鼠直立位约30 s-1 min，确保液体充分进入下呼吸道，继续培养小鼠24 h。

2. 肺泡灌洗液的制备

（1）将正常小鼠和急性肺炎小鼠分别麻醉后，仰卧固定，充分暴露颈部和胸部区域，做好操作区域的消毒处理。

（2）用眼科剪在小鼠颈部正中做长约1 cm的切口，逐层分离皮肤、皮下组织和肌肉，暴露白色气管。

（3）将1 mL注射器连接气管插管（26G头皮针），针头平行插入气管内，插入深度控制在0.8-1 cm。

（4）缓慢推注PBS（2 mM EDTA+1% BSA），剂量为0.5-1 mL/次（可根据小鼠体重灵活调整）。

（5）推注完成后停留5-10 s，可轻按摩小鼠胸部，促进生理盐水与肺泡充分接触，随后轻柔回抽灌洗液。

（注：肺泡灌洗液自然回收率较低，通常为50%-70%，可重复灌洗3-4次；全程需将收集的灌洗液置于冰上保存，避免样本变质影响后续检测。）

3. 流式检测

1）将收集好的肺泡灌洗液300 × g离心3-5 min，离心完后去掉上清，留下白色沉淀。

（2）加入Cell Staining Buffer重悬，调整细胞密度至1×10⁷/mL。

（3）取100 μL细胞悬液，加入CD16/32封闭抗体，轻轻吹打混匀，4℃封闭孵育15 min。

（4）再加入流式检测抗体，轻轻吹打混匀，继续4℃孵育30 min，加入1-2 mL的Cell Staining Buffer重悬细胞，轻轻吹打后150 × g离心3-5 min。

（5）弃上清，再加入100-300 μL的Cell Staining Buffer重悬细胞，流式上机检测。

图2. 小鼠肺泡巨噬细胞检测流程示意图

三、流式结果分析

1. 圈门策略

（1）AMs（肺泡巨噬细胞）：选择活细胞，再从CD45⁺选中CD64⁺MerTK⁺双阳为AMs。

（2）cDC（经典树突状细胞）：上述CD64^-MerTK^-细胞群进一步分析，CD11c⁺MHC II⁺细胞为cDC。

（3）Eos（Eosinophil，嗜酸性粒细胞）：上述CD64^-MerTK^-细胞群进一步分析，Siglec-F⁺CD11c^-细胞群为Eos。

（4）Neu（Neutrophil，中性粒细胞）：上述CD64^-MerTK^-细胞群进一步分析，CD11b⁺Gr-1⁺细胞群为Neu。

注意：①最好设置MHC II/CD64/MerTK的ISO对照。②使用CD16/32封闭会对CD64产生影响，可先染色CD64，再加入CD16/32封闭，然后再染色其他指标。

2. 正常小鼠肺泡灌洗液巨噬细胞流式检测结果展示

图3. C57BL/6J小鼠肺泡灌洗液巨噬细胞流式检测结果展示

C57BL/6J小鼠取肺泡灌洗液样本，使用小鼠CD45、CD64、MerTK、CD11c、MHC II、Siglec-F、CD11b、Gr-1流式抗体染色并使用流式细胞仪检测分析巨噬细胞的功能分型。

从上图可以看出，在正常小鼠肺泡灌洗液中，以MerTK高表达为特征的肺泡巨噬细胞（AM）占CD45⁺细胞的84.58%，非肺泡巨噬细胞群体（Non AM）占CD45⁺细胞的13.85%。随后对Non AM群体进行细分，鉴定出经典树突状细胞（cDC）占Non AM细胞的6.53%，嗜酸性粒细胞（Eos）占Non AM细胞的1.40%，中性粒细胞（Neu）占Non AM细胞的42.98%。该图说明了正常小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞的主导地位。

3. 正常vs急性肺炎小鼠肺泡灌洗液巨噬细胞流式检测结果对比

图4. 正常vs LPS诱导的急性肺炎小鼠肺泡灌洗液巨噬细胞流式检测结果对比

正常小鼠和LPS诱导的急性肺炎小鼠取肺泡灌洗液样本，使用小鼠CD45、CD64、MerTK、CD11c、MHC II、Siglec-F、CD11b、Gr-1流式抗体染色并使用流式细胞仪检测分析巨噬细胞的功能分型。

从上图可以看出，LPS诱导的急性肺炎小鼠相较于健康对照组小鼠而言，肺泡灌洗液中的巨噬细胞比例降低，从84.58%下降到10.70%；cDC也从6.53%下降到0.41%；嗜酸性粒细胞从1.40%下降到0.46%；而中性粒细胞占Non AM的比例大幅增长，从42.98%上升到96.34%。

这直观地展示了LPS诱导的急性肺损伤模型中，肺泡灌洗液（BALF）免疫细胞群体的剧烈重塑。在LPS刺激24小时后，肺部微环境发生了从“稳态维持”向“急性炎症爆发”的根本性转变。中性粒细胞取代了原本的常驻细胞，成为BALF中的绝对优势群体，而肺泡巨噬细胞的比例则出现了断崖式下跌。

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参考文献

[1] Wu X, Wu L, Wu Y, et al. Heme oxygenase-1 ameliorates endotoxin-induced acute lung injury by modulating macrophage polarization via inhibiting TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Free Radical Biology and Medicine. 2023;194:12-22.

[2] Cheng P, Li S, Chen H. Macrophages in Lung Injury, Repair, and Fibrosis. Cells. 2021;10(2):436

[3] Pyung YJ, Park DJ, Kim CG, Yun CH. Remodeling and Restraining Lung Tissue Damage Through the Regulation of Respiratory Immune Responses. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2023;20(3):329-339.

[4] Wang L, Li D, Yang K, et al. The role of immunometabolism in macrophage polarization and its impact on acute lung injury/acute respiratory distress syndrome[J]. Frontiers in Immunology, 2023, 14: 1117548.

[5] Lu HL, Huang XY, Luo YF, et al. Activation of M1 macrophages plays a critical role in the initiation of acute lung injury. Bioscience Reports. 2018;38(2).

[6] Duan M, Steinfort DP, Smallwood D, et al. CD11b immunophenotyping identifies inflammatory profiles in the mouse and human lungs. Mucosal Immunology. 2016;9(2):550-563.