Elabscience | BV2细胞M1极化造模与流式检测，这份Protocol请收好

在神经退行性疾病的研究中，小胶质细胞极化是解析脑内慢性炎症的关键切入点，而BV2 细胞系是目前体外造模最常用工具。很多科研人员在实验中常会遇到M1极化诱导效率低、流式标志物选择混乱、诱导时长把控不准等难题，反复摸索浪费大量时间。本文将从机制梳理到实操指南，把BV2细胞M1极化的全套Protocol一站配齐。

一、神经退行性疾病研究现状

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）与帕金森病（Parkinson's disease, PD）是最常见的中枢神经退行性疾病，构成了全球老龄化社会面临的严峻健康挑战。全球AD患病人数正急剧攀升，而PD在过去三十年间患病率增长了74.3%，预计到2040年患者数量将翻倍^[1]。然而，当前针对这两大疾病的治疗手段仍以症状缓解为主，缺乏能够有效延缓或逆转疾病进程的疗法^[1,4]。这一困境迫使学界重新审视神经退行性疾病的根本病理机制。

为什么神经元会不断死亡？过去数十年间，大量遗传学、病理学及影像学证据指向一个核心因素——慢性神经炎症^[1,2]。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过80个AD相关的独立遗传风险位点，通路分析表明固有免疫与适应性免疫应答是AD发病的关键通路。值得注意的是，近四分之一的潜在AD遗传风险基因在小胶质细胞中高度或特异性表达^[1]。在PD中，同样观察到了黑质致密部大量活化的小胶质细胞堆积以及促炎因子的显著升高。

在这场神经炎症的"火灾"中，小胶质细胞，作为大脑的常驻免疫细胞，究竟是"消防员"还是"纵火犯"？答案并非非黑即白，而是高度取决于它的极化状态。

二、小胶质细胞——大脑的"双面免疫哨兵"

小胶质细胞是中枢神经系统特有的巨噬细胞，起源于胚胎早期的卵黄囊前体细胞，占脑内胶质细胞的5%–20%。它们以分枝状的静止态广泛分布于脑实质中，通过不断伸缩其突起监测微环境的细微变化，构成大脑的第一道免疫防线^[3]。小胶质细胞表面表达丰富的模式识别受体，能够敏锐识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），如Aβ聚集体、α-突触核蛋白等异常蛋白，并迅速启动免疫应答^[3,4]。

图1. 阿尔茨海默病中的局部神经元与小胶质细胞相互作用^[1]

在阿尔茨海默病中，稳态小胶质细胞被Aβ和tau等病理蛋白激活，触发NLRP3炎症小体，释放IL-1β和IL-18。IL-1β促进tau磷酸化及神经纤维缠结形成；激活的神经元转而释放TNF、IL-6、活性氧等因子，加剧神经损伤。持续炎症可导致小胶质细胞焦亡，释放ASC斑点，进一步促进Aβ聚集。同时，补体C3过度标记突触，导致突触被异常清除；缺乏“别吃我”信号的神经元甚至会被小胶质细胞完全吞噬。

在不同微环境信号的刺激下，小胶质细胞可极化为功能迥异的亚型。经典分类将其划分为M1型（促炎/神经毒性）与M2型（抗炎/神经保护）^[3]。M1型小胶质细胞在脂多糖、干扰素-γ等刺激下活化，释放大量促炎因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6以及活性氧和氮氧化物，这些介质可直接诱导神经元损伤并加剧突触毒性^[3,4]。在PD和AD患者的脑脊液及血清中，这些促炎因子水平显著升高，且与认知功能下降和疾病进展密切相关^[1,4]。相反，M2型小胶质细胞在IL-4、IL-13等信号诱导下表达精氨酸酶-1、CD206、TREM2等标志物，分泌IL-10、转化生长因子-β等抗炎因子，并增强吞噬清除Aβ和细胞碎片的能力，促进组织修复与神经元存活^[3]。

极化平衡的意义在于M1/M2的动态平衡决定着神经炎症的走向。在AD和PD的病理进程中，长期异常的蛋白聚集和DAMPs持续激活小胶质细胞，使其向M1表型倾斜，而M2保护性表型则相对不足，形成"促炎-神经损伤-更多DAMPs释放"的恶性循环^[2,4]。因此，促进小胶质细胞从M1向M2表型的转化，已成为神经退行性疾病治疗策略的重要研究方向。

图2. 小胶质细胞的激活表型^[3]

图中分别标明了诱导经典（M1）或替代（M2）激活途径的分子，并展示了不同极化细胞（M1、M2a、M2b、M2c 和 M2d）所表达的分子。

三、BV2细胞——研究小胶质细胞的“利器”

BV2细胞系是源自新生小鼠小胶质细胞、经v-raf/v-myc逆转录病毒永生化而建立的细胞系，是目前研究小胶质细胞功能与极化机制最常用的体外模型之一。BV2细胞保留了原代小胶质细胞的关键特征，包括表达TLR4受体、响应LPS等刺激后释放炎症因子，以及呈现M1/M2极化状态的能力^[5]。该细胞系自1992年建立以来，已成为连接体外机制研究与体内动物模型的重要桥梁工具，具有以下几种优点：

1. 稳定传代、易于基因操作：BV2细胞可稳定传代培养，消除了反复从新生小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的繁琐过程，显著减少了实验动物的使用需求^[6]。其永生化特性使其特别适合进行基因转染、RNA干扰和CRISPR编辑等遗传操作，为信号通路机制研究提供了便利。

2. 对LPS等刺激反应灵敏，可诱导明确的M1/M2极化：BV2细胞表面高表达TLR4受体，LPS刺激后通过MyD88依赖途径激活NF-κB和MAPK信号通路，诱导经典M1型极化，释放大量促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2等^[5,7]。同时，通过加入IL-4、IL-13等因子可诱导M2型极化，表达ARG-1、CD206、IL-10等抗炎标志物。

3. 实验结果可重复性好：相较于原代小胶质细胞，BV2细胞系提供了高度均一的细胞群体，消除了个体差异和分离纯化过程中的批次效应，确保实验结果具有良好的可重复性^[7]。

四、BV2细胞极化培养及流式检测流程

1. 通用准备

BV2细胞复苏、传代扩增至对数生长期。消化收集细胞（BV2细胞贴壁较松，胰酶消化时间不宜过长，需轻柔吹打），调整细胞密度至合适浓度（建议5×10⁵个/mL），铺板于合适培养板，使用完全培养基（含10%FBS的高糖DMEM）进行培养，于37°C、5% CO₂培养箱中贴壁过夜。

2. M1极化

弃去旧培养基，更换为含LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）的新鲜完全培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养24 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

3. M2极化

弃去旧培养基，更换为含IL-4（20 ng/mL）和IL-13（20 ng/mL）的新鲜完全培养基。于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养24 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

图3. BV2细胞极化培养流程

4. 流式检测

（1）收集细胞悬液，150 × g离心3 min；

（2）弃上清，加入Cell Staining Buffer（E-CK-A107）或PBS缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1-10×10⁶个/mL;

（3）取100 μL细胞悬液，每组加入2 μL Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody（E-AB-F0997A），轻轻吹打混匀，室温避光孵育10 min封闭细胞表面的Fc受体；

（4）加入各流式抗体（5 μL/test），轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30 min；

（5）孵育完成后，每管加入1 mL Cell Staining Buffer（E-CK-A107）轻轻吹打混匀，150 × g离心3 min，弃上清。

（6）加入200 μL Cell Staining Buffer（E-CK-A107）重悬细胞沉淀，上机检测。

5. 细胞因子检测

（1）收细胞前4 h，向细胞中加入Cell Stimulation MIX（E-CK-A019）和Protein Transport Inhibitor MIX（E-CK-A013），轻轻吹打混匀。

（2）收集细胞，按照Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer Kit（E-CK-A109）说明书流程先对其他抗体进行表染，然后进行固定破膜后再加入TNF-α抗体染色，流式检测细胞因子的表达。

6. BV2细胞向M1型巨噬细胞极化结果

向BV2细胞中加入LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）诱导其向M1极化，分别在诱导24 h和48 h后进行收样，流式检测BV2细胞F4/80、CD86、CD206及TNF-α的表达，对比不同诱导时间对极化效果的影响。

图4. BV2细胞M1极化检测结果

分别使用LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）处理BV2细胞24或48 h后，进行流式检测BV2细胞F4/80、CD86、CD206及TNF-α的表达，对比这两种条件的诱导效果。

由图可见，与无处理的Control组细胞相比，LPS+IFN-γ诱导细胞24 h时，BV2细胞的F4/80表达不明显，M1型巨噬细胞比例为17.88%（CD86⁺CD206^-）；而诱导48 h时，BV2细胞的F4/80表达相对于Control组明显上调，M1型巨噬细胞比例进一步增加，可达到80.27%，且细胞表达的TNF-α相对于Control组也明显升高。说明诱导BV2细胞48 h可以达到更好的M1极化效果。

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参考文献

[1]Heneka MT, van der Flier WM, Jessen F, et al. Neuroinflammation in Alzheimer disease. Nature Reviews Immunology. 2024;25(5):321-352. DOI: 10.1038/s41577-024-01104-7

[2]Yao J, Wang Z, Song W, Zhang Y. Targeting NLRP3 inflammasome for neurodegenerative disorders. Molecular Psychiatry. 2023;28(11):4512-4527. DOI: 10.1038/s41380-023-02239-0

[3]Wang Z, Weaver DF. Microglia and microglial-based receptors in the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease. International Immunopharmacology. 2022;110:109070. DOI: 10.1016/j.intimp.2022.109070

[4]Dong-Chen X, Yong C, Yang X, Chen-Yu S, Li-Hua P. Signaling pathways in Parkinson's disease: molecular mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2023;8(1). DOI: 10.1038/s41392-023-01353-3

[5]Cao CY, Yang YX, Xie Z, et al. Derivatives of sarcodonin A isolated from Sarcodon scabrosus reversed LPS-induced M1 polarization in microglia through MAPK/NF-κB pathway. Bioorganic Chemistry. 2022;125:105854. DOI: 10.1016/j.bioorg.2022.105854

[6]Das A, Kim SH, Arifuzzaman S, et al. Transcriptome sequencing reveals that LPS-triggered transcriptional responses in established microglia BV2 cell lines are poorly representative of primary microglia. Journal of Neuroinflammation. 2016;13(1). DOI: 10.1186/s12974-016-0644-1

[7]Chen HL, Yang L, Zhang XLN, et al. Scutellarin Acts via MAPKs Pathway to Promote M2 Polarization of Microglial Cells. Molecular Neurobiology. 2023;60(8):4304-4323. DOI: 10.1007/s12035-023-03338-3