Elabscience|巨噬细胞极化总失败？RAW264.7/THP-1/BMDM/hMDM四大模型避坑指南与实操全攻略

巨噬细胞是肿瘤、炎症、神经退行性疾病、组织修复等热点领域的核心研究对象，M1/M2极化更是近年来国自然与顶刊的常客。然而，RAW264.7传代后“躺平”、BMDM提取量少、THP-1诱导后漂浮，这些困境几乎人人经历过，而这些困境背后往往只是某个实验细节的疏忽。本文聚焦巨噬细胞研究中最常用的细胞系（RAW264.7、THP-1）和原代细胞模型（BMDM、hMDM），手把手梳理制备流程与注意事项，助你养出“听话”的好细胞。

一、Raw264.7细胞极化流程及表面标志物检测方案

1. Raw264.7细胞极化培养及流式检测流程

• 通用准备：RAW264.7细胞复苏、传代扩增至对数生长期，消化收集后调整细胞密度至2.5×10⁵个/mL，铺板于合适培养板，使用完全培养基（含10%FBS的高糖DMEM）进行培养，于37°C、5% CO₂培养箱中贴壁过夜。

• M1极化：弃去旧培养基，更换为含LPS（300 ng/mL）和IFN-γ（200 ng/mL）的全培养基，或者直接使用M1型Raw264.7巨噬细胞极化培养和检测试剂盒（XJM004）继续培养24-48 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

• M2极化：弃去旧培养基，换为无血清培养基饥饿处理16-20 h；再更换为新鲜全培养基静息培养24 h；最后加入IL-4和IL-13（50-100 ng/mL）诱导培养24-48 h，完成M2极化。

• 流式检测：

（1）收集细胞悬液，150 × g离心3 min；

（2）弃上清，加入Cell Staining Buffer或PBS缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1-10×10⁶/mL;

（3）取100 μL细胞悬液，每组加入2 μL Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody，轻轻吹打混匀，室温避光孵育10 min封闭细胞表面的Fc受体；

（4）加入各流式抗体（5 μL/test），轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30 min；

（5）孵育完成后，每管加入1 mL Cell Staining Buffer轻轻吹打混匀，150 × g离心3 min，弃上清；

（6）加入200 μL Cell Staining Buffer重悬细胞沉淀，上机检测。

图1. Raw264.7细胞极化培养流程

2. Raw264.7细胞向M1型巨噬细胞极化结果

图2. Raw264.7细胞M1极化检测结果

使用M1型Raw264.7巨噬细胞极化培养和检测试剂盒（XJM004）检测并分析结果，由图可见与无处理的Control组细胞相比，M1型巨噬细胞有短而密的伪足，细胞质内颗粒感明显增加，流式检测高表达F4/80、CD11b、CD86。

• 注意事项：

（1）M1型诱导最佳条件：2.5×10⁵个/mL细胞铺板，培养基条件为：DMEM高糖培养基+20%灭活血清+双抗，加入含LPS (300 ng/mL) + IFN-γ (200 ng/mL），诱导48 h；

（2）不同状态的Raw264.7细胞诱导条件有差异，F4/80本底表达越高，获得的M1纯度越高；

（3）形态学分析：成熟度越高的M1型巨噬细胞，伪足越明显，细胞内囊泡结构越明显；

（4）Raw264.7细胞极易自发分化：细胞从圆形变为四角形或伸出伪足时，说明状态改变，需及时传代。

3. Raw264.7细胞向M2型巨噬细胞极化结果

图3. Raw264.7细胞M2极化检测结果

使用流式抗体检测并分析结果，由图可见和无处理的Control组细胞相比，M2型巨噬细胞呈梭状，有细而长的伪足，流式检测高表达F4/80、CD11b、CD206。

注意事项：

（1）无血清饥饿培养16-20 h后静息培养24 h，再加入IL-4和IL-13更有利于细胞向M2型转化；

（2）IL-4和IL-13的浓度增加有利于M2表型表达；

（3）使用胰酶消化半分钟，然后直接使用移液器轻轻吹打辅助细胞脱落，再迅速加入全培养基终止消化，消化过度会影响CD206的检测。

Elabscience^®相关产品推荐

货号	产品名称
XJM004	RAW 264.7 极化 M1 型巨噬细胞诱导与鉴定试剂盒
E-CK-A107	细胞染色缓冲液
E-AB-F0997A	纯化标记抗小鼠 CD16/32 抗体 [2.4G2]
E-AB-F1081F	PerCP 标记抗小鼠/人/猴 CD11b 抗体 [M1/70]
E-AB-F1081J	PerCP/Cyanine5.5 标记抗小鼠/人/猴 CD11b 抗体 [M1/70]
E-AB-F0995C	FITC 标记抗小鼠 F4/80 抗体 [CI:A3-1]
E-AB-F0994D	PE 标记抗小鼠 CD86 抗体 [GL-1]
E-AB-F1135E	APC 标记抗小鼠 CD206/MMR 抗体 [C068C2]

 

二、THP-1细胞极化流程及表面标志物检测方案

1. THP-1细胞极化培养及流式检测流程

通用准备（M0分化阶段）：THP-1细胞复苏、传代扩增至对数生长期。THP-1为悬浮细胞，计数后调整细胞密度至合适浓度（建议3-5×10⁵个/mL），铺板于合适培养板。加入PMA（100-200 ng/mL）于完全培养基（含10%FBS的RPMI-1640）中，于37°C、5% CO₂培养箱中诱导分化24 h，使其分化为贴壁的静息态巨噬细胞（M0）。

M1极化：PMA诱导24 h后，弃去含PMA的旧培养基，使用无菌PBS或基础培养基轻柔洗涤细胞1-2次。更换为含LPS（1 μg/mL）和IFN-γ（100-200 ng/mL）的新鲜完全培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养24 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

M2极化：PMA诱导24 h后，弃去含PMA的旧培养基，使用无菌PBS或基础培养基轻柔洗涤细胞1-2次。更换为新鲜完全培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中静息培养24-48 h（此步可使M0细胞状态趋于稳定，有利于后续极化响应）。再更换为含LPS（1 μg/mL）+IL-4（50-100 ng/mL）+IL-13（50-100 ng/mL）的新鲜完全培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养24-48 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

流式检测：同Raw264.7细胞流式检测步骤。

图4. THP-1细胞极化培养流程

2. THP-1细胞向M1型巨噬细胞极化结果

图5. THP-1细胞M1极化检测结果

使用流式抗体检测并分析结果，由图可见M1细胞伪足少且短，细胞质颗粒感明显,和无处理的Control组细胞相比高表达HLA-DR、CD86、CD68，低表达CD206。注：确保初始细胞状态最佳，细胞活性强、传代稳定，即可获得稳定的重复性结果。

3. THP-1细胞向M2型巨噬细胞极化结果

图6. THP-1细胞M2极化检测结果

使用流式抗体检测并分析结果，由图可见M2巨噬细胞呈长梭形、纤维细胞样，形状不规则，和无处理的Control组细胞相比高表达CD206和CD163，低表达HLA-DR和CD86。

 

注意事项：

（1）THP-1极化M2最佳条件：3.5×10⁵/mL接种细胞，PMA（100-200 ng/mL）培养16-20 h后，使用全培养基轻轻浸润洗涤2-3次，去除PMA，再加入新鲜培养基，静息培养24 h后，继续加入LPS+IL-4+IL-13继续培养24-48 h；

（2）去除PMA时必须洗净，残留会影响后续实验结果；

（3）消化细胞使用胰酶时，消化30-60 s后即轻轻吹打促进细胞脱落，然后快速加入含FBS的培养基终止消化。消化过久会影响CD206/CD163/CD68表型，但对CD86表型影响较小。

Elabscience^®相关产品推荐

货号	产品名称
E-CK-A107	细胞染色缓冲液
E-AB-F0997A	纯化抗小鼠 CD16/32 抗体 [2.4G2]
E-AB-F1012D	PE 标记抗人 CD86 抗体 [BU63]
E-AB-F1161E	APC 标记抗人 CD206/MMR 抗体 [15-2]
E-AB-F1111Q	Elab Fluor® Violet 450 标记抗人/猴 HLA-DR 抗体 [L243]
E-AB-F1299L	Elab Fluor® 488 标记抗人 CD68 抗体 [Y1/82A]
E-AB-F1298J	PerCP/Cyanine5.5 标记抗人/猴 CD163 抗体 [GHI/61]

 

三、小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）极化流程及表面标志物检测方案

1. BMDM极化培养及流式检测流程

BMDM的分离与培养：

（1）处死小鼠后，将小鼠置于75%乙醇中浸泡5 min进行灭菌消毒。

（2）完整取出其双侧股骨和胫骨，剔除骨上附着的肌肉和组织。

（3）将清洗好的股骨、胫骨分开，并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断，使用注射器吸取预冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹洗3次，直至骨内看不到明显的红色为止。

（4）反复吹打，将块状的细胞团吹散。

（5）然后使用70 μm细胞滤器将细胞过筛，转移至15 mL离心管中，300 × g离心5 min，弃上清。

（6）加入红细胞裂解液重悬，混悬细胞沉淀，室温静置2 min后，加入10 mL PBS进行洗涤。

（7）300 × g离心5 min，弃上清，收集细胞即可进行铺板培养。如果使用小鼠单核细胞分选试剂盒（MIM010N）进行操作，可以进一步提升细胞纯度。

通用准备：分离小鼠股骨/胫骨骨髓细胞，或复苏冻存的BMDM前体细胞。使用含M-CSF（20 ng/mL）的完全培养基（含10%FBS的高糖DMEM）重悬细胞，调整至合适密度铺板。于37°C、5% CO₂培养箱中培养诱导分化72 h（期间第48 h左右进行半量换液并补足新鲜M-CSF），使其分化为贴壁的静息态巨噬细胞（M0）。

M1极化：弃去含M-CSF的分化培养基，使用无菌PBS或基础培养基轻柔洗涤细胞1-2次。更换为含LPS（300 ng/mL）和IFN-γ（200 ng/mL）的新鲜完全培养基，继续培养24 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

M2极化：弃去含M-CSF的分化培养基，使用无菌PBS或基础培养基轻柔洗涤细胞1-2次。更换为补充有M-CSF（20 ng/mL）+IL-4（20 ng/mL）+IL-13（20 ng/mL）的新鲜完全培养基，继续培养24 h。诱导结束后收集细胞或上清，用于后续检测。

流式检测：同Raw264.7细胞流式检测步骤。

图7. BMDM极化培养流程

注：M-CSF条件培养基培养过程中，需观察细胞状态，培养基变黄后，注意补液，一般48 h时补充二分之一体积的培养基。

2. BMDM向M1型巨噬细胞极化结果

图8. C57小鼠骨髓来源巨噬细胞M1极化检测结果

使用流式抗体检测并分析结果，由图可见与同型对照组相比，极化后M1型巨噬细胞高表达F4/80和CD86。

3. BMDM向M2型巨噬细胞极化结果

图9. C57小鼠骨髓来源巨噬细胞M2极化检测结果

使用流式抗体检测并分析结果，由图可见，与同型对照组相比，极化后M2型巨噬细胞高表达F4/80和CD206。

4. BMDM极化M1和M2型巨噬细胞形态对比

图10. C57小鼠骨髓来源巨噬细胞极化M1和M2形态对比

由图可见M1型巨噬细胞偏圆形，伪足较少且细胞质颗粒感明显，而M2型巨噬细胞呈长梭形、纤维细胞样。

注意事项：

（1）BMDM贴壁非常牢固，消化时间比一般细胞系长，需在显微镜下观察；

（2）全程保持无菌操作，冰上操作时冰不要放入超净台内；

（3）红细胞裂解时间不宜过长（不超过10 min），以免损伤有核细胞。

Elabscience^®相关产品推荐

货号	产品名称
E-CK-A107	细胞染色缓冲液
E-AB-F0997A	纯化抗小鼠 CD16/32 抗体 [2.4G2]
E-AB-F0995J	PerCP/Cyanine5.5 标记抗小鼠 F4/80 抗体 [CI:A3-1]
E-AB-F0995Q	Elab Fluor® Violet 450 标记抗小鼠 F4/80 抗体 [CI:A3-1]
E-AB-F0994C	FITC 标记抗小鼠 CD86 抗体 [GL-1]
E-AB-F1135E	APC 标记抗小鼠 CD206/MMR 抗体 [C068C2]

 

四、人外周血单核细胞来源巨噬细胞（hMDM）极化流程及表面标志物检测方案

1. hMDM极化培养及流式检测流程

• 单核细胞的收集和转化

（1）用肝素钠抗凝管收集新鲜的人外周血样本，经Human PBMC Separation Solution(P 1.077)分离出PBMC，用预冷的完全培养基重悬细胞，150 × g离心5 min，弃上清。

（2）用预冷的完全培养基重悬细胞计数，调整细胞密度至1.5-2×10⁶/mL，加入终浓度为50 ng/mL的M-CSF，轻轻吹打混匀，在37°C, 5% CO₂的培养箱中培养24 h，促进细胞贴壁及巨噬细胞转化。

（3）取出培养皿，轻柔混匀后吸弃上清液与未贴壁细胞；加入适量完全培养基洗涤细胞，再次弃去上清。随后分别加入含不同细胞因子的培养基，诱导细胞向M1型、M2型巨噬细胞极化。

• M1极化：在贴壁的单核巨噬细胞中，加入含LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）的全培养基，继续培养48 h后收集细胞，显微镜下观察细胞的形态，细胞整体呈现“煎饼状”扁平结构，细胞伪足明显，细胞质内颗粒度较多。收集细胞并检测细胞极化效果。

• M2极化：在贴壁的单核巨噬细胞中，加入含IL-4（20 ng/mL）和IL-13（20 ng/mL）的全培养基，继续培养48 h后收集细胞，显微镜下观察细胞的形态，细胞整体呈细长形、纺锤形或星形，具有明显的伸长特征。收集细胞并检测细胞极化效果。

• 流式检测：同Raw264.7细胞流式检测步骤。

图11. hMDM极化培养流程

2. 正常人外周血单核细胞流式检测结果

图12. 正常人外周血单核细胞流式检测结果展示

正常人外周血使用人CD45、CD11b、CD14、CD68、CD86、CD206、CD163流式抗体标记后进行流式细胞仪分析，由图可见正常人外周血中的单核细胞比例约为9.69%（CD45⁺CD11b^mid/highCD14⁺），而其中几乎不含巨噬细胞（CD68⁺）。

3. hMDM向M1、M2型巨噬细胞极化结果

图13. 正常人外周血及PBMC诱导培养后巨噬细胞流式检测结果展示

正常人外周血及向M1和M2极化诱导培养的PBMC使用人CD45、CD11b、CD14、CD68、CD86、CD206、CD163流式抗体标记后进行流式细胞仪分析。由图可见：

（1）人PBMC在经过诱导培养后，CD68⁺表达量明显升高，说明巨噬细胞比例显著增加；

（2）M1极化组CD86⁺CD206^-比例占单核/巨噬细胞的64.62%，说明M1型巨噬细胞比例明显增加；

（3）M2极化组CD86^-CD206⁺比例占单核/巨噬细胞的26.11%，但是并没有细胞表达CD86^-CD163⁺，说明该组主要诱导的是M2a型巨噬细胞（M2a高表达CD206，M2c高表达CD163）。

 

注意事项：

（1）进行PBMC分离时，离心务必慢升慢降（升降速调至最低），以免扰乱分层界面；吸取白膜层时动作轻柔，避免吸入分离液或血浆层杂质。

（2）分化初期（前24 h）避免换液，此时细胞贴壁尚不稳定，过早换液会导致细胞漂浮。

Elabscience^®相关产品推荐

货号	产品名称
E-CK-A103	人外周血单个核细胞分离液（P 1.077）
E-AB-F1137C	FITC 标记抗人 CD45 抗体 [HI30]
E-AB-F1081D	PE 标记抗小鼠/人/猴 CD11b 抗体 [M1/70]
AN00213Q	Elab Fluor® Violet 450 标记抗人 CD14 抗体 [H332-1B10]
E-AB-F1299M	Elab Fluor® 647 标记抗人 CD68 抗体 [Y1/82A]
E-AB-F1012H	PE/Cyanine7 标记抗人 CD86 抗体 [BU63]
E-AB-F1161M1	Elab Fluor® 700 标记抗人 CD206/MMR 抗体 [15-2]
E-AB-F1298J	PerCP/Cyanine5.5 标记抗人/猴 CD163 抗体 [GHI/61]

 

四种模型，覆盖了从细胞系到原代细胞、从鼠源到人源的主要研究场景。每个模型的培养条件、诱导窗口和检测抗体各有差异，摸透它们的特性，严控每个操作细节，方能收获可靠数据。愿这篇梳理助你避开常见陷阱，养出状态在线的好细胞。如果你在巨噬细胞培养、极化诱导、流式检测过程中遇到各类实操难题，欢迎在评论区留言交流实验经验。