细胞不成瘤、流式结果差？荷瘤小鼠造模+肿瘤单细胞悬液制备实操全攻略

做肿瘤动物实验，最让人崩溃的三件事：细胞种下去不出瘤、肿瘤取出来提不出单细胞、上机流式杂细胞太多、背景爆炸。很多实验不是课题设计不行，而是动物造模+样本前处理细节翻了车。

今天小E给大家整理一套可直接落地的荷瘤小鼠-完整实验链路：从细胞系选型避坑、标准化造模，到肿瘤组织单细胞悬液制备、流式上机质控，为您的肿瘤研究动物模型制备实验提供坚实支持。

一、荷瘤小鼠的模型制备方案和分类

荷瘤小鼠根据细胞来源主要分为CDX（Cell-line Derived Xenograft）模型和PDX（Patient-Derived Xenograft）模型。

CDX将体外培养的肿瘤细胞系接种至免疫缺陷小鼠，标准化程度高、周期短、成本低，是应用最广泛的肿瘤动物模型；PDX直接移植患者新鲜肿瘤组织，不受体外培养筛选压力影响，可保留肿瘤原生基质、细胞互作与肿瘤异质性，但制备流程复杂、操作门槛更高。

两类模型不存在绝对优劣，需结合研究目标选择：快速开展化合物活性筛选或分子靶点验证时优先选用CDX；而预测药物临床疗效、探究肿瘤异质性演化或开发个体化治疗方案，PDX凭借超80%的预测准确率更具优势。CDX与PDX的详细对比见表1。

表1. CDX模型和PDX模型的详细对比汇总

对比维度	CDX （细胞系来源异种移植）	PDX （患者来源异种移植）
全称	Cell-line Derived Xenograft	Patient-Derived Xenograft
肿瘤来源	已建立的永生化人或大小鼠等的肿瘤细胞系（经体外长期培养、筛选和传代）	患者新鲜手术切除肿瘤组织，绕过体外培养，直接移植
制备流程	对数生长期细胞→PBS/Matrigel重悬→皮下/原位/尾静脉注射（常规5 × 106/200 μL）	新鲜肿瘤组织→切成2-3 mm3碎片→皮下/原位植入→F1→F2→F3连续传代扩增
宿主小鼠	裸鼠/NOD-SCID/NSG等，根据细胞系成瘤能力灵活选择	需高度免疫缺陷品系（NSG/NOG），以hen大化降低排斥反应、提升移植成功率
成瘤周期	1-4周，速度快、同步性好	2-4个月，潜伏期长、个体差异大
肿瘤异质性	低。体外长期培养导致优势克隆富集、丧失瘤内异质性（ITH），肿瘤趋于均质化	高。很大程度保留原始肿瘤的基因突变谱、克隆结构和肿瘤内异质性
肿瘤微环境（TME）	严重缺失。肿瘤主要由癌细胞构成，缺乏原始基质细胞、免疫浸润和细胞外基质信号	相对保留。移植的肿瘤碎片保留了原始基质成分和细胞间互作，但随着传代增加，人源基质会被鼠源基质逐步替代
基因组保真度	低。体外长期培养导致显著的遗传漂变（Genetic drift），基因表达谱与原始肿瘤差异大。黑色素瘤CDX以低氧诱导基因签名为特征（hsa-miR-210过表达），与PDX的基因表达谱明确分离为不同的聚类簇	高。在早期代数（F1-F3）中与原始患者肿瘤保持高度相似的突变谱和基因表达模式，但随着传代增加也可能发生克隆漂变
临床预测价值	~5%。因丧失异质性和TME，药物响应结果极少能准确预测临床疗效	>80%。认为是最具临床预测价值的临床前模型；预测能力显著优于CDX和GEMM
核心优势	①操作标准化、技术门槛低； ②成本低、周期短； ③成瘤同步性好、可重复性高； ④适合大规模高通量药物筛选； ⑤细胞系资源丰富，选择灵活。	①保留原始肿瘤的组织病理结构和分子特征； ②高度再现瘤内异质性； ③临床预测价值最高，可用于共临床试验（co-clinical trial）和个体化药敏测试； ④可系列传代建库，形成"PDX化身库"。
核心局限	①体外长期培养导致遗传漂变和表型重塑； ②缺乏肿瘤异质性； ③TME基本丧失； ④药物响应预测准确性极低； ⑤难以模拟转移过程	①基质替代（人基质→鼠基质）； ②克隆漂变（传代中优势克隆选择性扩增）； ③周期长、成本高； ④移植成功率因肿瘤类型而异（如卵巢癌为58%）； ⑤传统PDX缺乏免疫系统，无法直接评估免疫疗法。
免疫治疗评估	不适用。需在免疫缺陷小鼠中生长，无法评估免疫检查点抑制剂等	不适用（传统PDX）。需转向人源化小鼠PDX（在NSG中重建人免疫系统后移植PDX）
典型应用场景	①药物研发初期的大规模筛选； ②靶点验证和机制研究（当肿瘤异质性非核心关注点时）； ③药代动力学/药效学（PK/PD）研究； ④快速获取统计效力充足的数据。	①个体化精准医学。为患者筛选最优方案； ②新药临床前共临床试验； ③耐药机制研究； ④生物标志物发现与验证； ⑤肿瘤进化与克隆动力学研究。
成本与通量	低成本、高通量。适用于批量药物筛选，数百只小鼠可同步进行	高成本、低通量。单个模型建库需数月，资源消耗大

二、荷瘤小鼠易成瘤/难成瘤细胞系盘点

细胞系成瘤能力的差异是肿瘤学实验中最重要的变量之一。以下对文献中有明确体内成瘤数据支持的常见细胞系进行了归类：

（1）高成瘤性细胞系（易成瘤）：这类细胞系在标准接种条件下（5 × 10⁶细胞、皮下注射至裸鼠），通常1-4周内即可形成稳定肿瘤，成瘤率>80%，具体汇总如下表所示：

表2. 高成瘤性细胞系（易成瘤）汇总

细胞系	推荐通道/滤光片	适用场景
HCT116	人结肠癌	成瘤速度快，广泛用于结肠癌CDX建模
A549	人非小细胞肺癌	经典肺癌模型细胞系，成瘤稳定
HT-29	人结肠癌	高成瘤性且对化疗耐药，适合难治性肿瘤研究
PC-3	人前列腺癌	去势抵抗性前列腺癌经典细胞系，成瘤率高，配合Matrigel可进一步提升成瘤率
MDA-MB-231	人三阴性乳腺癌	高侵袭性，广泛用于乳腺癌干性研究和转移模型
SK-OV-3	人卵巢癌	经体内筛选的亚系（IP2）成瘤性显著增强，低接种量即可形成腹腔肿瘤
HL60	人急性早幼粒白血病	亲本HL60-G高成瘤性，但经长期1,25D3处理后成瘤性可大幅降低
4T1	小鼠乳腺癌	接种1×106–5×106即可成瘤，>95%，自带肺/肝/骨转移
CT26.WT	小鼠结直肠癌	皮下接种1×103-1×106，成瘤率>90%，7–14天成瘤，免疫治疗研究中公认的高可靠性结肠癌模型
MC38	小鼠结直肠癌	常规皮下接种1×106个细胞，成瘤率可达100%。高突变负荷、免疫原性强、成瘤稳定为核心特点，是肿瘤免疫治疗研究中公认的标杆模型
EMT6	小鼠乳腺癌	成瘤率80-90%，转移倾向低
H22	小鼠肝癌	腹水型，成瘤率>95%，生长快、成本低
PAN02	胰腺癌	皮下1×106-2×106接种，成瘤率均可达90%；以低免疫原性、高纤维化、成瘤稳定为核心特点，是模拟人胰腺癌免疫冷肿瘤微环境的标杆模型
RENCA	肾癌	皮下1×105-1×106个接种，成瘤率均可达90%；以高成瘤稳定性、高度模拟人肾癌转移特征为核心特点，是肾癌免疫治疗和转移研究的标杆模型
A20	小鼠B细胞淋巴瘤	皮下2×106或2×107接种，成瘤率均可达100%，成瘤时间分别约为15天和7天；尾静脉注射2×106组成瘤率约71.4%，2×107组为100%；脾脏注射约71.4%；腹腔注射仅14.3%
B16-F1/B16-F10	小鼠黑色素瘤	F10是肺转移亚系，成瘤极快（5–10天），成瘤率>95%
LLC1 （Lewis肺癌）	小鼠肺癌	皮下接种1×106-2×106个细胞，成瘤率可达90%-100%，接种后7-10天即可观察到明显肿瘤结节

（2）中等成瘤性细胞系：成瘤率50-80%，可能需要特定条件（如Matrigel辅助、更高接种量或特定品系小鼠）。

表3. 中等成瘤性细胞系（需特殊处理）汇总

细胞系	肿瘤类型	优化条件
OVCAR-3	卵巢癌	腹腔注射优于皮下，Matrigel或胶原基质可提升成瘤率。
NCI-H727	肺类癌	斑马鱼异种移植模型中可评估成瘤和血管生成。
XGC-1	胃癌	需BALB/C裸鼠皮下接种验证成瘤性。

（3） 低成瘤性/难成瘤细胞系：这类细胞系在标准条件下成瘤率低（<50%）、潜伏期长或需特殊处理。

表4. 低成瘤性/难成瘤细胞系汇总

细胞系	肿瘤类型	难成瘤的可能原因与对策
基底样乳腺癌细胞系（如台湾绝经前患者来源的KBC系列）	乳腺癌	不同种族来源的基底样乳腺癌细胞系成瘤性极低，可能与特定的遗传背景和表观遗传特征相关。
ccRCC 原代细胞	透明细胞肾细胞癌	标准极限稀释法（LDA）显著低估其成瘤性。组织解离过程会杀死大部分ccRCC细胞，而完整肿瘤碎片移植的成瘤效率远高于单细胞悬液。

三、肿瘤单细胞悬液的制备和流式检测

肿瘤相关流式实验做不出来，很多时候问题卡在样本制备上：组织剪不碎、消化过度、细胞死太多、成团严重。这套方案专门适配肿瘤组织，上机结果干净、阳性率准确。

1、实验准备

（1）动物和试剂：6-8周龄健康BALB/c小鼠、75%乙醇、RPMI 1640基础培养基、优质胎牛血清、青霉素-链霉素溶液（双抗）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、无菌去离子水、无菌PBS、Cell staining buffer（E-CK-A107）、10×ACK Lysis Buffer（E-CK-A105）等。

（2）耗材：一次性无菌注射器、细胞培养皿、移液器吸头、实验小鼠，无菌300目尼龙滤膜、无菌15/50 mL离心管、眼科剪、眼科镊。

（3）流式检测抗体如下表所示

试剂名称	货号
STYX™ Yellow Fixable Viability Kit	E-CK-A169
FITC Anti-Mouse/Human CD11b Antibody[M1/70]	E-AB-F1081C
Elab Fluor® Violet 450 Anti-Mouse CD45 Antibody[30-F11]	E-AB-F1136Q
PerCP/Cyanine5.5 Anti-Mouse F4/80 Antibody[CI:A3-1]	E-AB-F0995J
APC Anti-Mouse CD86 Antibody[GL-1]	E-AB-F1135D
APC Anti-Mouse CD86 Antibody[GL-1]	E-AB-F0994E
Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody[2.4G2]	E-AB-F0997A
Elab Fluor® 700 Anti-Mouse MHC II (I-A/I-E) Antibody[M5/114]	E-AB-F0990M1

2、实验操作流程

1）试剂配制

a. 配制含10% FBS、1%双抗的RPMI-1640完全培养基，4全培保存备用。

b. 肿瘤消化液为胶原酶IV（1 mg/mL）与DNase I（100 μg/mL消化）溶于RPMI-1640，现用现配。

2）4T1荷瘤模型制备

a. 取对数生长期4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞，三阴性，高转移性），胰酶消化后PBS洗涤，重悬于无血清培养基调整至5 × 10⁶ 个/mL。

b. 于6-8周龄BALB/c雌鼠右侧背部皮下接种100 μL悬液。移植后第13天，经测量肿瘤体积约900 mm³，经CO₂吸入法安乐si后行颈椎脱臼确认死亡，剥离肿瘤。

c. 剪成1 mm³小块，加入消化液于37，加振荡消化30-60 min，每10 min吹打一次。终止后过70 μm筛，PBS洗涤得单细胞悬液。

注：所有动物实验均经本单位实验动物伦理委员会审查批准，并遵循实验动物福利与3R原则。

3）肿瘤组织的单细胞悬液制备

A. 混合酶消化法

a. 待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至1.5 mL EP管中或细胞培养皿中，剪成1 mm³小块，加入肿瘤消化液于37，加振荡消化30-45 min，每10 min吹打一次。

b. 消化结束后，迅速加入5-10 mL全培养基轻轻吹打混匀，终止消化，随后将肿瘤组织悬液转移至15 mL离心管中，250 50g离心5 min，弃上清。

c. 加入5-10 mL的1640基础培养基或者PBS稀释，再用200目筛网，除去残留的组织块，并使用5-10倍体积的1640基础培养基或者PBS缓冲液洗涤一次，过滤至无组织块为止，获得单细胞悬液。

d. 收集细胞悬液，300×g离心5 min，弃上清。

e. 用细胞染色缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

注：也可根据需要使用后续实验相应的缓冲液调整细胞密度到合适的范围，例如使用细胞分选液调整细胞到合适的密度，以用于后续的细胞分选。

B. 研磨法

a. 提前准备好200目的一次性细胞筛网，用1640基础培养基或者PBS润湿并浸泡备用（浸泡放置于6 cm细胞培养皿或者6孔板）。

b. 将剥离的肿瘤组织转移到200目的细胞筛网，用无菌眼科剪剪成小颗粒。

c. 取2.5 mL注射器活塞，用软头打圈方式研磨组织，研磨至筛网上无明显的组织块为止，取新鲜的1640培养基或者PBS冲洗筛网2-3次。

d. 将获得的细胞悬液用200目细胞筛网过滤。

e. 收集细胞悬液，300 00g离心5 min，弃上清。

f. 用细胞染色缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

注：也可根据需要使用后续实验相应的缓冲液调整细胞密度到合适的范围，例如使用细胞分选液调整细胞到合适的密度以用于后续的细胞分选。

3）流式检测

a. 细胞悬液离心后加入ACK裂解液裂解红细胞，裂解完成后补加PBS终止裂解；PBS洗涤细胞并进行细胞计数。

b. 调整细胞浓度至1 × 10⁷ cells/mL，取100 μL（1 × 10⁶细胞）转移至流式管，加入0.5-1 μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体（E-AB-F0997A）封闭Fc受体，室温孵育10 min；随后直接加入荧光标记抗体，4℃避光孵育染色30 min。

c. 染色结束后使用PBS或Cell staining buffer（E-CK-A107）洗涤，重悬于PBS或Cell staining buffer中上机检测。

3、实验结果展示

图1. BALB/c小鼠4T1移植瘤中肿瘤相关巨噬细胞TAMs的检测。BALB/c小鼠颈部皮下注射4T1细胞20天后，取荷瘤组织，酶解法制备单细胞悬液，使用死活染料、流式抗体CD45、CD11b、F4/80、MHC-II、CD206、CD86对4T1移植瘤中的巨噬细胞进行检测，结果显示M1型巨噬细胞占比25.65%，M2型巨噬细胞占比6.55%。

图2. BALB/c小鼠4T1移植瘤中肿瘤相关T细胞的检测。BALB/c小鼠颈部皮下注射4T1细胞13天后，取荷瘤组织，酶解法制备单细胞悬液，使用死活染料、流式抗体CD45、CD3、CD4、CD8对4T1移植瘤中的T细胞进行检测。

4、实验注意事项

（1）肿瘤体积一般不超过1000 mm³，肿瘤质量在0.6-0.8 g之间。（若肿瘤较大下述各反应体系加倍）。

（2）酶消化法剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1 mL的枪头自由吸取，无阻碍。

（3）酶消化法时要避免组织消化过度，需要每隔20 min取出观察，无明显组织块后即结束消化；细胞团块越小，消化越快，1 mL移液器可以吹打的组织块，约消化30-60 min即可完成；若组织难以剪切，也可以切成大小1-2 mm³左右大小，每10 min用1 mL的移液器吹打混匀一次，直至1 mL移液器吹打时组织团块可以顺畅通过，全程消化约30-60 min。

（4）研磨时为尽量减少细胞损伤，需要浸泡于培养基中研磨，避免干磨。

肿瘤动物模型实验，造模成功率、样本前处理直接决定后续流式检测结果。不管是CDX/PDX模型选择、细胞系成瘤能力评估，还是肿瘤单细胞悬液制备，每一步细节都会影响最终实验数据。

希望本篇实操指南可以帮大家避开动物实验常见坑，获得稳定可靠的流式检测结果。

如需了解更多新品详情、获取完整产品列表，可访问Elabscience^®官网或咨询当地经销商。

关注Elabscience^®，第一时间获取新品资讯与实验技术干货。

参考文献

[1] LONG Y, XIE B, SHEN H C, et al. Translation Potential and Challenges of In Vitro and Murine Models in Cancer Clinic[J]. Cells, 2022, 11(23): 3868.

[2] XU C, LI X, LIU P, et al. Patientranslation Potential and Challenges of In Vitro and Murine Models in Cancer Clinic[J]. Oncology Letters, 2018.

[3] ZENG M, RUAN Z, TANG J, et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice[J]. Cancer Cell International, 2023, 23(1). .

[4] GOTO T. Patient-Derived Tumor Xenograft Models: Toward the Establishment of Precision Cancer Medicine[J]. Journal of Personalized Medicine, 2020, 10(3): 64.

[5] TSUMURA R, KOGA Y, HAMADA A, et al. Report of the use of patientlishment of Precice[J]. ine Models in Cancer Clinic[J]. Cancer Science, 2020, 111(9): 3386-3394.

[6] JIN J, YOSHIMURA K, SEWASTJANOW-SILVA M, et al. Challenges and Prospects of Patient-Derived Xenografts for Cancer Research[J]. Cancers, 2023, 15(17): 4352.

[7] DE VLIEGHERE E, CARLIER C, CEELEN W, et al. Data on in vivo selection of SK-OV-3 Luc ovarian cancer cells and intraperitoneal tumor formation with low inoculation numbers[J]. Data in Brief, 2016, 6: 542-549.

[8] WANG X, PONZIO N M, STUDZINSKI G P. Long-Term Exposure of HL60 Cells to 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Reduces Their Tumorigenicity: A Model for Cancer Chemoprevention[J]. Experimental Biology and Medicine, 1997, 215(4): 399-404.

[9] CARRA S, GAUDENZI G, DICITORE A, et al. Modeling Lung Carcinoids with Zebrafish Tumor Xenograft[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(15): 8126.

[10] PENG J, XU H, CAI J. Establishment and characterization of a new gastric cancer cell line, XGC-1[J]. Cancer Cell International, 2020, 20(1).

[11] KUO W L, UENG S H, WU C H, et al. Establishment of two basal-like breast cancer cell lines with extremely low tumorigenicity from Taiwanese premenopausal women[J]. Human Cell, 2018, 31(2): 154-166.

[12] GEDYE C, SIRSKYJ D, LOBO N C, et al. Cancer stem cells are underestimated by standard experimental methods in clear cell renal cell carcinoma[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1).