生物素,是一个分子量只有 244.31 Da 的小分子,经活化后可与蛋白、抗体等生物大分子结合,不仅可以很好地保持大分子的生物活性,而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用,使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。
那么如何使用生物素标记抗体或蛋白呢?下面给大家分享一下。
工具/原料
• 10 ul,50 ul,200 ul,1000 ul 可调高精度移液器
• 恒温箱(37 ℃)
• 离心机(离心力可达到 12,000×g)
• 生物素标记试剂盒(Cata.No:EBLK0002,Elabscience)
实验前准备
1. 仔细阅读使用说明书。
2. 计算待使用 NH2-Reactive Biotin 的量。
3. 提前 20 min 从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的 NH2-Reactive Biotin 继续放置冰箱中)。
4. 溶解 NH2-Reactive Biotin:加入 30 ul DMF 至 NH2-ReactiveBiotin 瓶中,静置 10 min,待其充分溶解,此时生物素的浓度为 10 mM。
操作步骤:(本操作步骤按照 1 mg 的量进行标记)
1. 取 1 mg 待标记抗体于 Filtration tube 中,并加入相应体积的 Labeling Buffer,使抗体的终浓度为 2 mg/ml,12,000 x g 离心 10 min。(注:①Filtration tube 的最大体积为 0.5 ml;②待标记抗体浓度低时,可先超滤离心一次)
2. 加入 13.3 ul NH2-Reactive Biotin 和适量 Labeling Buffer 至上述 Filtration tube 中,使终体积为 0.5 ml,并轻轻吹打混匀。放入 37 ℃ 恒温箱中避光温育 30 min。12,000 x g 离心 10 min。
3. 加入适量 Labeling Buffer 至上述 Filtration tube 中,使终体积为 0.5 ml,并轻轻吹打混匀,12,000 x g 离心 10 min。
4. 操作 3 重复一次。
5. 加 0.2 ml Labeling Buffer 至 Filtration tube 中,轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中,6,000 x g 离心 10 min。
6. 收集离心管中的溶液,即为生物素标记的抗体。