流式课堂 | 抗体滴定如何做？一文全解析

使用流式抗体时，抗体浓度是最关键的参数。新手老师随意添加，容易产生背景染色过深、样本浪费等问题。为了达到更好的实验效果，节约宝贵的样本，我们需要进行抗体滴定。

1 什么是抗体滴定

抗体滴定，是做流式实验之前，对所用流式抗体进行最佳的抗体用量和抗体浓度测定的实验，其目的是实现最优的信噪比，并且在多指标流式检测实验之前，对抗体配色发挥重要作用。

2. 为什么要做抗体滴定

一般情况下，生产厂家都会提供流式抗体的推荐使用量，但抗体的最佳使用浓度或“滴度”，与我们的检测目标、染色时间，以及温度、细胞是否固定等实验条件有关。

由于商业试剂不太可能在您所用的特定实验条件下进行测试，使用过多或过少的抗体，都会导致非特异性染色增加、信噪比降低、灵敏度降低、表达水平与染色强度之间缺乏线性关系等情况，增加了实验成本。因此，抗体滴定显得尤为重要。

3 如何做抗体滴定

① 抗体（以小鼠CD4为例）使用前，先12000 g离心1 min，去除底部团块。这些团块可能是抗体互相之间粘附形成的沉淀；

② 一般情况下，起始滴定浓度约10 µg/mL，做6~8个梯度。例如：抗体起始浓度为0.2 µg/µL，实验体系为100 µL，做6个浓度梯度：

 

管1：10 µL抗体 + 90 µL稀释液

管2：从管1取50 µL抗体+ 50 µL稀释液

管3：从管2取50 µL抗体+ 50 µL稀释液

以此类推

管6：从管5取50 µL抗体+ 50 µL稀释液，混匀后取出50 µL抗体弃掉

管7：只加入50 µL稀释液，用来做空白对照

这样，你本次滴定只使用了2 µg抗体

③ 将要标记的细胞，事先用适量的Fc受体阻断剂，室温孵育10 min；

④ 向每管稀释好的抗体中，加入50 µL约1×10⁶细胞，混匀，4°C避光孵育30 min；

⑤ 加入2 mL细胞染色缓冲液，轻轻混匀，300 g离心5 min；

⑥ 弃上清，用200 µL PBS重悬，上机检测，阳性细胞群至少获取500个事件。

4 如何计算滴定结果

一旦制定了滴定梯度，有几种方法可以评估数据以确定最佳滴定：

最简单的方法是计算SNR(信噪比)，即阳性群体的MFI (中位荧光强度)与阴性群体的MFI的比率。如图所示，抗体CD4-FITC的最佳抗体使用浓度为0.7 μg/mL（1:800稀释）。

 

▲Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct; 49(10): 1457–1973.

 

考虑到阴性群体的CV，另外一种方法就是计算染色指数（Staining Index，SI）：

如图所示，抗体CD4-PE的抗体使用浓度为1.25 μg/mL时，染色指数最大，此时为最佳使用浓度。

5. 抗体滴定注意事项

① 对于一些全阳的细胞，滴定时可以在样本染色后加入未染色的细胞；

② 对于CD3、CD4、CD8这类分群明显且间隔非常开的指标，只做细胞性质确定设门用的时候，可不进行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指标；

③ 对于表达量比较少的稀有细胞群体，在染色时，可加入该群细胞的父级细胞群的抗体；

④ 如果样本中有大量的死细胞，在滴定过程中，要先加入死活染料区分死活，再确定目标抗体的浓度；

⑤ 在一定的细胞密度范围内，抗体的染色指数只与抗体的浓度有关，与细胞密度无关。


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