Co-IP实验中轻重链干扰的解决方法

内容预告：本文将和大家一起探讨IP（免疫沉淀）实验中的轻重链干扰问题，分析如何减少这种干扰。
 

大家知道，免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。

目前多用精制的Protein A/G预先结合固化在凝胶磁珠（Agarose Beads）上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应，磁珠（Beads）上的Protein A/G就能吸附抗原，达到捕获目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定特定蛋白质新的作用搭档。

IP实验过程一般分为3个阶段

① 制备组织或细胞裂解液；

② 加入捕获抗体、Protein A(G)凝胶/磁珠，形成并纯化免疫复合物（IP complex）；

③ WB检测，SDS-PAGE分离免疫复合物，转膜，与特异性检测抗体孵育，加入酶标二抗，曝光显影。

 

要想减少IgG重链轻链对实验结果判断的干扰，首先要理解这些干扰是如何产生的：

 

                                                                   Fig 1. IP复合物（IP Complex）的结构

 

由图1可以看出，免疫沉淀复合物由三部分组成：ProteinA(G)凝胶、抗体IgG分子、目标蛋白。SDS-PAGE后，这些成分都会一起转移到膜上。当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候，二抗会识别捕获抗体的重链轻链分子，导致出现55kDa重链带、20~25kDa轻链带的干扰。

 

那么，如何避免这些杂信号的影响呢？

常见的方法有：

（1）捕获抗体、检测抗体采用不同来源物种，使用针对检测抗体物种的特异性二抗；

（2）有条件的话，捕获抗体采用没有恒定区的纳米抗体。
 

受限于经费预算与市场供应，上面两个解决方案都不是那么容易实现的。不过，如果您准备做标签蛋白的IP实验，Elabscience^®为您提供的解决方案，可以完美避开重链轻链杂信号的干扰。

01 如果您做的是FLAG、HA、MYC标签蛋白，建议选用Elabscience^®快速免疫沉淀试剂盒系列产品。

这个系列的试剂盒包括四种成分：针对标签的小鼠单抗偶联的亲和凝胶，针对标签的特异性兔多抗，针对兔IgG的、吸附过的特异性二抗，还有一支Mouse IgG 亲和凝胶作对照。试剂盒操作快速，简便，完全避开了重轻链等杂信号干扰。

关键是价格很实惠，一只普通一抗的价格，就可以搞定一个试剂盒。

 

 

02 如果您做的是GFP标签蛋白或者mCherry标签蛋白，建议选用Elabscience^®GFP纳米抗体磁珠凝胶产品、mCherry磁珠凝胶产品。

实验效果图如下：

Elabscience^®推出的标签抗体快速沉淀试剂盒套装，可进行50次IP实验，且无需额外购买一抗、二抗、IgG对照试剂。有了它，标签相关IP/Co-IP实验再也不用担心了！活动细节，请详询当地授权代理商。

套装组成(以FLAG标签快速免疫沉淀套装为例)

产品名称	货号	成分（规格）	保存条件
Anti-FLAG（DYKDDDDK） 亲和凝胶	EA-IP-001	共价偶联Anti-FLAG小鼠单抗的琼脂凝胶，2mL（0.5mL/mL）	-20℃，12个月
Mouse IgG亲和凝胶	EA-IP-100	共价偶联Mouse IgG的琼脂糖凝胶，2mL（0.5mL/mL）	-20℃，12个月
Flag-Tag Polyclonal Antibody一抗（宿主：Rabbit）	E-AB-40525	100μg（1mg/mL）	-20℃，12个月
Goat Anti-Rabbit IgG(peroxidase/HRP conjugated)二抗	E-AB-1003	100μg（1mg/mL）	-20℃，12个月

提示：表格中提及的产品，可登录Elabscience^®官方网站，输入货号进行搜索，查看产品详情
 

主要产品列表

产品名称	货号	规格	价格
Anti-FLAG标签（DYKDDDDK）快速免疫沉淀套装	EA-IP-K001	50 Tests	4380元
Anti-HA标签（YPYDVPDYA）快速免疫沉淀 套装	EA-IP-K002	50 Tests	4380元
Anti-MYC标签（EQKLISEEDL）快速免疫沉淀套装	EA-IP-K003	50 Tests	4380元

提示：表格中提及的产品，可登录Elabscience^®官方网站，输入货号进行搜索，查看产品详情

以上，是分享的Co-IP实验轻重链干扰解决之道，希望对大家的实验有帮助~