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Elabscience细胞功能 | 细胞周期检测异常实验结果分析

人阅读 发布时间:2024-02-06 14:01

细胞周期(Cell cycle)是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。细胞周期又可以分为间期(interphase)和有丝分裂期(M phase),细胞间期又常划分为休眠期(G0)、DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)、DNA合成后期(G2)。DNA周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况,即细胞增殖状况,常用于细胞增殖和肿瘤研究。
 

利用细胞内DNA能够和荧光染料结合的特性,细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同,流式细胞仪检测的荧光强度也不同,可检测细胞不同周期。
 

重要参数

这是一个正常的细胞周期检测结果,我们先看看一般细胞周期的结果需要关注哪些重要参数。

Dip G1、Dip G2、Dip S分别代表的是G0/G1期、G2/M期还有S期在总细胞中的占比。G2/G1代表的是G2/M期细胞的DNA含量与G0/G1期细胞的DNA含量的倍数关系,一般是在2左右。CV值指的是G0/G1期峰的变异系数,CV值越小,峰的形状就越好。RCS代表的是拟合曲线和真实数值的峰的拟合程度,一般在5以下是可以被接受的。


异常结果分析

细胞周期实验步骤相对来说比较简单,但是需要关注的细节可不少,一不小心就有可能做出异常的结果。接下来我们来看看一些细胞周期实验中出现的异常结果

碎片过多

① 固定导致细胞成团,吹打过度形成细胞碎片。虽然细胞周期实验中步骤少,但是对样本处理的要求较高。按照说明书要求,收集细胞洗涤离心后,需要先加0.3 mL的PBS重悬细胞,再加入1.2 mL的-20°C无水乙醇。很多老师就有疑问,为什么要先加PBS再加无水乙醇呢,不能直接加70~80%的乙醇吗?这里是不建议这样操作的,直接加70~80%乙醇会极易导致细胞成团,先加PBS将细胞充分混匀,再缓慢加入无水乙醇固定,这样细胞就不容易成团了。

② 药物处理过于剧烈,导致细胞死亡过多。实验前可先做预实验,对加药的浓度和时间做一个梯度测试,挑选合适的处理条件。


CV值过高

细胞周期检测中,CV是评价周期结果好坏的一个重要指标,CV结果越小越好,一般10%以内结果是可以被认可的。CV值过大的异常原因及相应解决方案如下:

异常原因

解决方案

细胞状态不佳、样本不新鲜

调整细胞状态,固定后尽快完成实验

RNA的干扰

加入RNase孵育

上样速度过快,导致分辨率降低

降低上样速度

仪器异常

进行仪器质控/校准

数据分析不合理

调整各时相位置、G2/G1比例

药物处理

加药处理后CV值上升是正常现象


G2/M期缺失

① 首先需要确认一下检测的细胞是不是能够进行分裂增殖的。比如外周血淋巴细胞在正常情况下基本上是不会进行增殖的,处于G0期。

② 如果细胞培养条件不对或营养不足,引起细胞生长缓慢,也会导致大量细胞进入G0期。此时需及时优化培养条件,否则时间一长会引起细胞状态变差,直至细胞死亡。

③ 很多细胞生长密度过高,会出现接触抑制,导致G2/M期缺失。当细胞产生接触抑制,就无法再继续增殖。因此,如果实验处理组是促进细胞生长,或导致G2/M期阻滞,有可能会出现完全检测不出来的情况,严重影响对实验结果的判断。所以,在进行细胞周期实验时,一定要保证检测时细胞尚有合理的生长空间,一般建议细胞量最大组细胞密度在80%,不超过90%。


正常体细胞周期检测出现8倍体,或4倍体比例过高

大多数老师用的样本都是2倍体或4倍体,当出现这种结果时就会奇怪了,为什么做出来的结果会出现8倍体,或4倍体比例过高。其实这种情况一般都是粘连体导致的,在周期实验数据分析时,需采用PI-A + PI-H来排除粘连体,就可以排除粘连体带来的干扰了。


样本自发荧光干扰

和其他的流式实验一样,实验前需要先了解一下自己的细胞、处理的药物是否有自发荧光,是什么荧光,对哪些检测通道会有干扰。周期数据分析时是不太好调补偿的,所以周期试剂盒选择时就要注意尽量选择避开样本自发荧光干扰的检测通道的荧光
 

目前市面上最常见的周期检测试剂是红色荧光检测,Elabscience对应的产品是Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence) E-CK-A351,可以用PI、PerCP、PE通道来检测。
 

针对自发荧光的细胞进行周期检测,我们还新推出了两个新的细胞周期试剂盒,满足您的不同的选择:

▇ Cell Cycle Assay Kit (Green Fluorescence) E-CK-A352:绿色荧光(Ex/Em:500/530),用FITC通道检测。

▇ Cell Cycle Assay Kit (Blue Fluorescence) E-CK-A353:蓝色荧光(Ex/Em:364/454),用DAPI通道检测。

以上就是为大家总结的细胞周期检测异常实验结果分析。如有更多细胞功能检测疑问,欢迎留言交流!

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