细胞因子流式检测做不好？别慌，你想要的答案都在这！

细胞因子流式检测总翻车？信号微弱甚至全无、背景噪音高、非特异性染色扎堆、细胞分群模糊还出双峰、数据波动大重复不出来……别头疼！小E这就带您逐一拆解高频问题根源，手把手奉上详细解决方案。

表1. 细胞因子检测常见问题

针对以上的问题，Elabscience从样本制备-刺激阻断-固定破膜染色-仪器检测和结果分析等核心环节入手，提供详细的问题排查与优化解决方案，方便大家快速掌握细胞因子检测。

（1）样本采集：EDTA抗凝会导致细胞活化、细胞因子降解，且螯合钙离子，影响细胞生产细胞因子，因此优先用肝素钠抗凝血。

（2）样本保存和处理：全血采集后尽量2 h内完成PBMC制备及相关分选处理，处理后的细胞4℃保存≤4 h。4℃保存过久会导致细胞状态变差，死细胞增多，信号丢失。

（3）样本长期保存：分选后的PBMC若无法及时检测，建议用含10% DMSO+90%FBS的冻存液程序降温后液氮保存，可稳定保存1个月，复苏后恢复活性即可进行后续实验操作。

（4）总结：采集新鲜的肝素钠抗凝血，充分混匀，2 h内于超净工作台无菌分离出PBMC后用RPMI 1640全培养基（RPMI-1640基础培养基+10%胎牛血清+1%P/S双抗+2 mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）重悬，检测细胞活率≥85%，调整细胞浓度至1-2×10⁶/mL后进行刺激阻断处理。

注：详细操作流程可参考人Th1/Th2 流式细胞术染色试剂盒（XJH001）及人Th17流式细胞术染色试剂盒（XJH002）说明书中的流程细节。

图1. 使用Human Th1/Th2 Flow Cytometry Staining Kit（XJH001）进行流式检测。正常PBMC细胞（Control）和经过Cell Stimulation MIX刺激的PBMC细胞（Stimulation group），CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺细胞（Q5-2）为Th1细胞，CD3⁺CD4⁺IL-4⁺细胞（Q6-2）为Th2细胞。

（1）取材与单细胞制备要及时：小鼠处死尽可能迅速。脾脏、淋巴结取出后立即放入预冷的PBS或含2%FBS的PBS或RPMI 1640基础培养基中，之后立即使用无菌玻璃研磨棒或润湿的细胞筛网（70 μm）轻柔研磨。全程冰上操作，离体后的组织不要室温放置超过10 min，否则会导致细胞自发活化自溶。

（2）组织细胞的研磨和吹散用巧劲儿：使用细胞筛网或者研磨棒研磨，注意将组织浸润在溶液中，轻柔研磨，避免用力过度和研磨过度。小体积的样本也可用镊子+注射器针头辅助吹散即可（骨髓样本及脾脏样本）。过度研磨和过度吹打会导致细胞状态差，死细胞增多，非特异性染色飙升。

（3）红细胞裂解（脾脏必须做）要适度：制备1×的红细胞裂解液后4℃预冷，眼观细胞悬液由红色浑浊变为澄清后迅速加入PBS等缓冲液并混匀以终止裂解。裂解过度会导致细胞状态差，非特异性染色飙升；裂解不充分会导致染色效果差，分群不清晰。

（4）单细胞样本的过滤+活细胞计数：细胞悬液必须过70 μm滤网过滤，去掉组织团块，否则可能导致上机堵针和细胞粘连；同时需检测细胞活率≥85%，若细胞活率过低（<70%）建议重做取材，否则可能导致结果信号弱或无阳性峰。

（5）细胞样本的分选选择：若想要获得更高比例的Th2/Th17/Th19或CD8⁺T细胞，建议使用分选试剂盒分选后再定向分化后检测，效果更佳。

注：详细的小鼠脾脏处理流程可参考小鼠Th1/Th2流式细胞术染色试剂盒（XJM001）和小鼠Th17流式细胞术染色试剂盒（XJM002）说明书（小鼠骨髓样本的注射器针头采集和实验流程请参考小鼠骨髓来源树突状细胞培养和鉴定试剂盒（XJM003）的说明书内容）。

图2. 使用EasySort™Mouse Naïve CD8+T Cell Isolation Kit（MIM008N）分选出脾脏Naïve CD8⁺T 细胞后使用Mouse CD3/CD28 T Cell Activation Beads (MIM001A)激活微球及细胞因子和活性抗体定向分化为TC1/TC2/TC3，刺激阻断后进行流式细胞因子检测。（TC1/TC17诱导条件：CD3/CD28 Beads+IL-2+IL-6+TGF-β；TC2诱导条件：CD3/CD28 Beads+IL-2+IL-4+Anti-IFN-γ）

表2. 各细胞因子最佳刺激时间表

（3）添加蛋白转运抑制剂：刺激同时要加入合适浓度的蛋白阻断试剂Brefeldin A (BFA)或Monensin，浓度过高会导致死细胞增多，浓度过低会导致阻断效果不明显，检测信号弱或无信号。也可选择使用细胞因子激活和蛋白阻断试剂盒（E-CK-A091）。

注：刺激阻断会导致CD4抗原内吞，PMA刺激的人和小鼠样本检测推荐选用SK3（人）和RM4-5（小鼠）克隆号的CD4抗体，这两个克隆号的抗原表位受内吞影响小，能有效维持流式分群清晰度。

图3. 人外周血使用人外周血单个核细胞分离液（P 1.077）（E-CK-A103）分选出PBMC后，使用Cell Stimulation and Protein Transport Inhibitor Kit（E-CK-A091）进行刺激阻断，收取细胞样本后使用FITC Anti-Human CD3 Antibody[OKT-3]（E-AB-F1001C）/PE Anti-Human CD4 Antibody[RPA-T4] （E-AB-F1109D）/APC Anti-Human IL-17A Antibody[BL168]（E-AB-F1173E）染色并流式分析，其中CD4的克隆号RPA-T4在刺激阻断后不分群。

图4. 人外周血使用人外周血单个核细胞分离液（P 1.077）（E-CK-A103）分选出PBMC后，使用Cell Stimulation and Protein Transport Inhibitor Kit（E-CK-A091）进行刺激阻断，收取细胞样本后使用PerCP/Cyanine5.5 Anti-Human CD3 Antibody[OKT-3]（E-AB-F1001J）/Elab Fluor^® 488 Anti-Human CD4 Antibody[SK3]（E-AB-F1352L）/PE Anti-Human IL-17A Antibody[BL168]（E-AB-F1173D）染色并流式分析，其中CD4的克隆号SK3在刺激阻断后分群良好。

表3. 细胞因子流式检测对照管功能与设置简明对照表

（1）仪器参数常校准：每日上机前校准微球校准流式细胞仪，确保信号稳定。

（2）样本上机控细节：细胞浓度保持在1-5×10⁶ cells/mL，密度过高可能导致上样针堵塞或检测结果分群不清晰；上机速度要适中，避免过快导致信号漏检。

（3）样本量收集要充足：至少收集5×10⁴个目标细胞（如CD4⁺T细胞），以保证统计可靠性。

（4）结果分析逐步细分：先用FSC/SSC圈定淋巴细胞，再用FSC-H和FSC-A排除细胞碎片、粘连体后，进一步用死活染料排除死细胞。最后按表面标志物进行细胞分群（如CD4⁺、CD8⁺T细胞），分析各细胞子集下的细胞因子表达（用同型对照或FMO对照设置全阴性门）。

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